胃癌组织中miR-184、Beclin1、LC3B 的表达及临床意义
2021-05-08刘丽霞张路杨丽
刘丽霞,张路,杨丽
石家庄市中医院,石家庄050000
胃癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤,其死亡人数位居消化道恶性肿瘤首位,且发病率仍呈居高不下的趋势[1]。因此,探索胃癌发展相关机制,找寻其中关键基因,对靶向治疗及研发药物具有重要作用。微小RNA(miRNA)是由前体RNA 经核糖核酸内切酶裂解后形成的非编码RNA,能够参与胚胎发育、免疫应答、炎症应激以及细胞分化等生理过程。miR-184 失活后能够阻遏磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN),而PTEN 作为一种抑癌基因,其活性下降后使胶质瘤细胞的增殖及分化能力增强,促进癌症进展[2]。对于自噬在肿瘤中的具体作用目前尚有争议[3]。Beclin1是酵母自噬相关基因(ATG)6 的同系物,位于人类染色体17q21 上,目前被广泛认为是一种抑癌基因,参与调控自噬过程[4]。在结肠癌组织中,Beclin1失活能够诱导噬底物P62聚集,通过NF-kβ 信号转导通路转导,促进结肠癌的进展[4]。微管相关蛋白1 轻链3B(LC3B)是ATG8 的同源基因,位于内层自噬泡,其含量与自噬的活性呈正相关[5],不同癌症组织中的LC3B 表达存在较大差异[6-7]。研究发现,miR-30a是调控自噬的关键基因,与Beclin1具有显著相关性[8],但是miR-184是否同样具有调控自噬的功能尚不清楚,与Beclin1和LC3B的相关性尚未可知。因此,笔者对胃癌组织中miR-184、Beclin1、LC3B的表达及临床意义进行了探讨。
1 资料与方法
1.1 临床资料 本院2018 年1 月—2020 年6 月收治胃癌患者103 例,男60 例、女43 例,年龄(58.32±9.88)岁;有淋巴结转移者21例,无淋巴结转移者82例;有Hp 感染者70 例,无Hp 感染者33 例;低分化9例,中分化41 例,高分化53 例;肿瘤长径≤3 cm 者53例,肿瘤长径>3 cm 者50 例;TNM 分期Ⅰ期42 例、Ⅱ期48 例、Ⅲ期8 例、Ⅳ期5 例。纳入标准:①符合国际抗癌联盟及美国肿瘤联合会胃癌的诊断准则[9],且术后病理确诊为胃癌;②患者均为首次确诊,且既往无胃部手术史或放化疗史;③全部患者均自愿协助参与本次研究,且临床资料齐全。排除标准:①合并胃部间质瘤、淋巴瘤及神经鞘瘤等肿瘤者;②合并胃穿孔或出血者;③重度肝硬化或慢性肾功能不全者;④合并其他原发恶性肿瘤者;⑤先天免疫系统缺陷者。本研究由医院伦理委员会批准实施,胃癌患者均已签署知情同意书。
1.2 研究方法 采用荧光实时定量PCR 技术检测miR-184、Beclin1 及LC3B 的表达。术中采集胃癌组织及其癌旁正常胃组织(距癌组织5 cm 处)放入液氮罐中暂存,术后置于-80 ℃冰箱中冷冻保存。两种样本各采集30 mg,将其剪碎滴加裂解液Trizol 试剂(Invitrogen 公司;批号20181226)后研磨。采用RNA抽提试剂盒(购自大连TaKaRa 公司,批号:20181223)提取总RNA,遵循操作步骤依次进行。总RNA通过逆转录试剂盒(购自BioRad公司,批号:20181230)逆转录为cDNA。通过SYBR Green Supermix Kit 试剂盒(购自BioRad 公司,批号:20181211)定量检测miR-184、Beclin1 及LC3B 的表达量。miR-184、Beclin1 及LC3B 的 反 应条件均为42 ℃30 min、85 ℃5 min。PCR 扩增体系为:正向引物1μL、反向引物1 μL、cDNA 3.0 μL、SYBR Green Supermix Kit10 μL 以及dH2O 5.0 μL,共计20 μL。miR-184 的正向引物序列为5'-GCTAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3'、反向引物序列为5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。Beclin1 的 正 向 引 物序列为5'-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3'、反向引物序列为5'-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3'。LC3B 的正向引物序列为5'-GAAGATGTCCGATCTATTCGAGAG-3'、反向引物序列为5'-ACTCTCATACACCTCTGAGATTGG-3'。 GAPDH 正向引物序列为5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'、反向引物序列为5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。引物序列上海吉玛生物公司合成制作。miR-184、Beclin1 及LC3B 的PCR 反应均为40 个循环,反应条件均为预变性95 ℃30 s、变性95 ℃10 s、退火60 ℃15 s、延伸72 ℃1 min,样本均设置3 个复孔。以相对Ct值法检测miR-184、Beclin1及LC3B的表达量,将ΔCt 值作为结果,相对于内参基因GAPDH 的比值为2-ΔΔCt,其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。
1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以±s表示,两组间比较应用独立样本t检验,多组间比较应用方差分析。相关性检验应用Pearson 相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌及癌旁组织miR-184、Beclin1 及LC3B 表达 胃癌组织中miR-184、Beclin1 及LC3B 的表达量较癌旁组织下降(P均<0.05)。见表1。
表1 胃癌及癌旁组织miR-184、Beclin1及LC3B表达比较(± s)
表1 胃癌及癌旁组织miR-184、Beclin1及LC3B表达比较(± s)
组别癌组织癌旁组织n 103 103 t P miR-184 1.85±0.67 3.21±1.02 11.310<0.05 Beclin1 0.86±0.33 1.69±0.75 10.280<0.05 LC3B 0.61±0.28 1.77±0.56 18.803<0.05
2.2 胃癌组织中miR-184、Beclin1 及LC3B 的表达量与临床病理参数的关系 胃癌组织中miR-184、Beclin1及LC3B的表达与淋巴结转移和TNM分期有关(P均<0.05),而与患者性别、分化程度、年龄、Hp感染及肿瘤大小无关(P均>0.05)。见表2。
2.3 胃癌组织miR-184、Beclin1 及LC3B 表达的相关性 胃癌组织miR-184表达量和Beclin1表达量呈正相关(r=0.845,P<0.05),miR-184 表达量和LC3B表达量呈正相关(r=0.787,P<0.05),Beclin1 表达量和LC3B表达量呈正相关(r=0.793,P<0.05)。
3 讨论
据循证医学统计,饮食习惯和地域差异是胃癌起病的重要危险因素。目前,临床治疗胃癌的主要方式是以手术为主、放化疗为辅的方案,但胃癌极易通过淋巴结或直接侵袭周围脏器发生转移,从而使患者的预后生存时间缩短。近年来,人类依靠基因测序技术对基因及其功能的研究逐步深化,基因在肿瘤的发生发展中所起到的作用逐渐被人们熟知。既往研究表明,DNA 甲基化、外泌体、LncRNA 以及miRNA 等因素能够阻遏或诱导原癌基因的表达,从而使细胞发生异常分裂及分化,对肿瘤的演变具有至关重要的作用[10-12]。
表2 胃癌组织中miR-184、Beclin1及LC3B的表达量与临床病理参数的关系
miRNA 广泛存在于真核生物中,其功能和序列具有高度保守性,通过调控多种靶基因及信号通路,参与肿瘤细胞分裂、分化及侵袭等过程。miR-184位于9 号染色体,最初在大鼠的小脑和心脏中被发现,能够调控血管源性疾病中新生血管的产生。在青光眼、白内障等疾病中,miR-184 通过调控免疫细胞分裂和凋亡使机体发生不同程度的氧化应激反应,导致视觉神经细胞受损[11]。在肾细胞癌组织中,miR-184能够结合红细胞膜蛋白带4.1类似物5的3,端,使其表达产物失活,从而调控癌症进展[10]。研究表明,miR-184 能够靶向结合丝氨酸/苏氨酸激酶基因,使胶质瘤细胞分裂受阻,同时促进胶质瘤细胞凋亡,使其侵袭能力下降[12]。本研究表明,胃癌组织中miR-184 的表达量较癌旁组织下降,其机制可能为癌细胞内的miR-184 自身发生甲基化,启动子沉默,从而导致miR-184表达下调;胃癌组织中miR-184的表达与淋巴结转移和TNM 分期有关,其机制可能为miR-184表达受阻诱导胞外信号调节激酶1活化,通过转移翻译其表达产物增加,从而使癌细胞周期缩短,分裂分化加快[12]。此外,下调的miR-184 通过激活肿瘤坏死因子-α,使血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子2 活化,促进癌细胞周围形成肿瘤新生血管,增强其转移和侵袭能力[11]。
自噬是一种高度保守的生理活动,在保障机体的正常生命活动、清理异常细胞和病原体等方面发挥关键作用[3]。自噬功能受损或缺陷能够损伤线粒体并产生大量的分子活性氧,从而使DNA 突变及染色体异常的风险增加[6]。Beclin1是组成自噬核心复合物的重要元件,能够结合Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶形成复合体,通过转换ATG蛋白在自噬前体的位置,调控自噬的活性[13]。既往研究表明,Beclin1 在乳腺癌组织中表达缺失,而上调其表达后能够定向破坏癌细胞,抑制其生长[14]。药物研究表明,Beclin1 高表达的癌细胞对顺铂的敏感性较高,使癌细胞凋亡的速度明显加快。本研究表明,胃癌组织中Beclin1的表达量较癌旁组织下降。其机制可能为癌细胞中Beclin1常呈单染色体缺失,使自身沉默子活化,导致Beclin1表达下调[15];胃癌组织中Beclin1 的表达与淋巴结转移和TNM 分期有关,其原因可能为Beclin1下调后能够诱导噬底物p62不断聚集,通过核转录因子信号通路的传导使快速癌细胞异常增生及分化[15]。同时,失活的Beclin1 通过调控凋亡基因的BH3 区域,使癌细胞逃避快速凋亡程序,转移和侵袭能力增强。
LC3 是一种重要的自噬体结构,包括Ⅰ型和Ⅱ型,主要存在于细胞质的自噬体膜上,与自噬功能密切相关[7]。自噬启动时LC3A 的启动子活化,生成的LC3A 靶向结合磷脂酰乙醇胺形成LC3B,对自噬活性的判断具有高度特异性。邓淑文等[16]在药物试验中发现,姜黄素通过上调LC3B表达使癌细胞增殖速度降低,并抑制其分裂。在非小细胞癌组织中,中成药物联合铂类药物能够激活LC3B,启动自噬机制,使机体内的自噬活动增强[17]。本研究表明,胃癌组织中LC3B的表达量较癌旁组织下降,其机制可能与癌细胞内免疫系统异常导致使自噬体溶解有关,而LC3B主要存在于自噬体膜上[7];胃癌组织中LC3B的表达与淋巴结转移和TNM 分期有关,其原因可能为LC3B下调后使机体自噬活性降低,诱导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达,激活AMP依赖的蛋白激酶,使癌细胞的分裂速度明显加快,同时诱导癌细胞发生上皮-间质转化,从而加强癌细胞的侵袭性[5,18]。
本文相关分析显示,miR-184和Beclin1、miR-184和LC3B、Beclin1和LC3B的表达量均呈正相关,提示miR-184、Beclin1及LC3B在胃癌中发挥的作用相似,均对胃癌的演变起到一定作用。miR-184 能够调控PI3K/Akt信号通路,而该通路是调节自噬活性的重要途径,Beclin1和LC3B均是自噬过程中的重要环节,这可能是miR-184、Beclin1 及LC3B 之间具有相关性的重要原因[19-20]。总之,胃癌组织中miR-184、Beclin1及LC3B的表达均降低,且与淋巴结转移和TNM分期密切相关,能够在一定程度上评估患者病情。