甲状腺乳头状癌患者血清miR-21、miR-221、miR-146a水平变化及其与临床特征的关系

陈霖霖，李正东，金从稳，刘浩，陈本鑫

皖西卫生职业学院附属医院，安徽六安237000

近年来甲状腺癌的发病率不断增加，研究显示有5%～15%的甲状腺结节最终确诊为甲状腺癌［1］；其中甲状腺乳头状癌（PTC）是甲状腺癌最常见的病理类型，多数患者可采用手术治疗。目前PTC 术前诊断的金标准是采用细针穿刺细胞学技术活检［2］，然而该项技术操作难度较高，患者依从性差，因此探讨诊断PTC的简便、有效方式具有重要的临床意义。微小RNA（miRNA）是一种核苷酸内源性非编码单链RNA，能够调控基因的表达［3］，甲状腺癌组织中miR-21、miR-221、miR-146a 的表达水平可出现明显异常［4-5］。目前关于诊断PTC 的血清标志物的研究仍处在初级阶段，故本研究探讨血清miR-21、miR-221、miR-146a 的联合检测对PTC 的诊断价值，并分析其与临床特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018 年6 月—2020 年6 月皖西卫生职业学院附属医院收治的85 例甲状腺结节患者为研究对象，根据术后病理学诊断结果分为观察组（PTC患者）和对照组（良性结节患者）。观察组43例，男18例、女25例，年龄35～63（49.21±6.92）岁。对照组42 例，男19 例、女23 例，年龄37～66（48.91±7.01）岁。观察组纳入标准：①符合PTC的诊断标准［6］，并经病理学确诊；②临床资料完整；③精神状态正常，能配合治疗。观察组排除标准：①其他病理类型甲状腺癌；②合并其他部位恶性肿瘤；③重要器官功能障碍；④肿瘤远处转移；⑤术前接受过化疗或放疗患者。两组患者性别构成及年龄比较差异无统计学意义（P均＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 血清miRNA 的检测 空腹状态下采集患者外周静脉血5 mL 置于血清分离管内，充分混匀并置于室温下。将试管置于3 000 r/min 的离心机内充分离心15 min，获取所得上层血清，将其分为两等份后置于EP 管内，并保存于-80 ℃冰箱内。应用实时免疫荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测两组血清中miR-21、miR-221、miR-146a 的表达水平。使用RecoverAll TM 核酸分离试剂盒从所得血清中提取总体RNA。cDNA 逆转录和RT-PCR 根据相关说明书，使用全合一的TM-miRNA 和RT-PCR 检测试剂盒进行。PCR 反应在95 °C 下预热10 min，然后在95 °C 下变性40 个循环，每次10 s，在60 °C 下退火20 s，在72°C 下延伸10 s。miRNA 的引物序列由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计。miR-21 上游引物：5'-GGGGTAGCTTATCAGACTG-3'，下游引物：5'-TGGAGTCGGCAATTGCACTG-3'。miR-221 上 游引 物：5'-TTGAGAAGTTTGTGCAGTCG-3'，下 游 引物：5'-TGCGTATACACTTTGGCAT-3'。miR-146a 上游引物：5'-TGTTGCTGAAGAGCTCTGGTAC -3'，下游 引 物：5'-TCGTCTGATGATGTCGAATGTAC-3'。内参U6 上游引物：5'-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。每个样本重复进行3 次，以U6 作为内参，并 通 过2-ΔΔCt方 法 计 算miR-21、miR-221、miR-146a的相对含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Pearson相关系数检验。使用受试者工作特征（ROC）曲线评价检测指标对PTC 的诊断性能，曲线下面积（AUC）越大，其诊断价值越高，AUC的比较采用z检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清miR-21、miR-221、miR-146a 表达 观察组血清miR-21、miR-221 表达水平高于对照组，miR-146a 表达水平低于对照组，差异具有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组血清miR-21、miR-221、miR-146a表达水平比较（±s）

表1 两组血清miR-21、miR-221、miR-146a表达水平比较（±s）

组别观察组对照组n 43 42 t P miR-21 3.05±1.03 1.13±0.34 8.367＜0.05 miR-221 2.98±0.95 1.09±0.24 9.021＜0.05 miR-146a 0.85±0.23 1.69±0.48 6.517＜0.05

2.2 不同临床特征PTC 患者血清miR-21、miR-221、miR-146a表达 PTC 患者中肿瘤长径＞2 cm、有包膜侵犯、临床分期Ⅲ期、有淋巴结转移患者血清miR-21、miR-221 表达水平增加，miR-146a 表达水平降低（P均＜0.05）。见表2。

表2 不同临床特征PTC患者血清miR-21、miR-221、miR-146a表达比较（±s）

表2 不同临床特征PTC患者血清miR-21、miR-221、miR-146a表达比较（±s）

临床特征性别n miR-21-x±s t p miR-221-x±s t p miR-146a-x±s t p 0.321 0.109 0.506 0.115 0.431 0.124男 女18 25 2.98±0.95 3.07±1.05 2.95±0.94 3.01±0.98 0.83±0.22 0.86±0.27年龄（岁）≥50＜50病灶单发多发肿瘤长径（cm）＞2≤2包膜侵犯有 无临床分期（期）Ⅰ～ⅡⅢ淋巴结转移有 无26 17 21 22 24 19 22 21 17 26 23 20 3.09±1.08 3.02±0.98 2.97±0.92 3.08±1.06 3.86±1.05 2.98±0.84 3.91±1.06 2.91±0.82 2.89±0.81 3.64±1.03 3.49±1.23 2.67±0.71 0.806 0.901 6.521 7.806 8.237 7.624 0.104 0.127 0.018 0.002 0.001 0.004 2.99±0.97 2.96±0.94 3.06±1.04 2.95±0.91 3.61±1.02 2.91±0.82 3.75±1.08 2.82±0.75 2.79±0.81 3.49±1.13 3.52±1.08 2.64±0.57 0.781 0.896 6.631 6.917 7.813 8.226 0.124 0.157 0.016 0.005 0.002 0.001 0.89±0.28 0.82±0.21 0.88±0.24 0.84±0.21 0.69±0.18 0.98±0.26 0.64±0.16 0.99±0.25 0.97±0.29 0.79±0.17 0.71±0.14 0.98±0.29 0.534 0.754 4.987 5.138 5.037 6.807 0.137 0.137 0.023 0.017 0.019 0.009 TI-RADS分级0.719 0.208 0.697 0.217 0.904 1.135 4 5 34 9 3.07±1.04 2.99±0.94 2.99±0.96 2.96±0.93 0.89±0.26 0.81±0.21

2.3 PTC 患者血清miR-21、miR-221、miR-146a 表达的相关性 经Pearson 相关性分析显示，PTC 患者血清miR-21 与miR-221 表达呈正相关（r=0.738，P＜0.05），miR-146a 与miR-21 及miR-221 表达呈负相关（r分别为-0.726、-0.599，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-21、miR-221、miR-146a 诊断PTC 的ROC 曲线 血清miR-21、miR-221、miR-146a 诊断PTC 的AUC分别为0.790、0.796、0.289，三者联合诊断PTC 的AUC为0.914，均高于单独指标的诊断价值（z分别为2.934、2.817、3.014，P均＜0.05）。

3 讨论

PTC 生物学惰性较高，多数患者预后较好，然而仍有报道显示接近10%～30%的PTC 患者确诊时已出现转移，影响患者预后［7］，因此早期诊断治疗PTC具有重要的临床意义。目前临床上多采用穿刺活检法确诊PTC，但其对临床医师操作、制作切片等技术要求较高，同时属于有创操作，部分患者难以接受［8］。目前采用血清学肿瘤标志物诊断PTC 简单、迅速，但仍存在灵敏度和特异性较低等问题，因此探讨各类血清肿瘤标志物的单独及联合检测价值日益迫切。

miRNA 是存在于真核生物体内的一种非编码单链RNA，可作为原癌基因及抑癌基因参与肿瘤生物学途径［9］。研究表明，早期食管癌患者血清miRNA-19a、miRNA-9 表达水平明显增加，miRNA-218表达水平明显降低，三者联合诊断早期食管癌的敏感度达90.00%、特异度达92.50%［3］。本研究表明，观察组患者血清miR-21、miR-221 表达高于对照组，而miR-146a 表达水平降低，进一步行Pearson 相关性分析显示，miR-21与miR-221表达呈正相关，miR-146a 与miR-21 及miR-221 表达呈负相关，PTC 患者血清中上述miRNA 指标出现明显异常。这与既往多项临床研究结论一致［10-12］。上述研究主要以探讨单项miRNA 在甲状腺癌中的表达为主，目前仍缺乏多项血清miRNA 指标的联合检测在甲状腺癌诊断及预后中的应用。本研究采用ROC 曲线评估miR-21、miR-221 及miR-146a 的单独及联合检测在诊断PTC 中的价值，结果显示三项指标AUC分别为0.790、0.796、0.289，而联合检测诊断PTC 的AUC达0.914。笔者认为由于miRNA 检测操作简便，患者易接受，临床上miR-21、miR-221、miR-146a 联合检测能明显提高PTC 的诊断价值，这对于PTC 的早期筛查具有重要的临床意义。

本研究分析不同临床特征PTC患者血清miR-21、miR-221、miR-146a 表达水平发现，肿瘤长径＞2 cm、有包膜侵犯、临床分期Ⅲ期、有淋巴结转移患者血清miR-21、miR-221 表达水平增加，而miR-146a 表达水平降低，这表明miR-21、miR-221、miR-146a 表达水平对肿瘤恶性程度也有一定的指示作用。miR-21位于人体17q23.2 号染色体位置，具有明显的原癌基因性质。研究显示，miR-21 在PTC 组织中表达水平较高，且高表达与肿瘤浸润相关［13］，主要是与miR-21 可抑制下游靶基因的转录与翻译，继而促进肿瘤细胞增殖与侵袭有关［14］。研究显示，在多种恶性肿瘤中miR-221 可通过下调PTEN 来增强Akt 的磷酸化发挥致癌性［15］。因此miR-221 对PTC 恶性程度的影响也可能与下调PTEN 从而增强Akt 信号通路有关。miR-146a 能够启动细胞增殖，通过与靶RNA的特异性结合抑制RNA翻译，miR-146a蛋白表达减少会降低肿瘤细胞的黏附能力，继而抑制肿瘤的转移［16］，未来miR-146a 蛋白可能成为PTC 靶向治疗的分子靶点。

综上所述，PTC 患者血清miR-21、miRNA-22l 表达明显上调，而miR-146a 表达水平下降，三者均可作为判断肿瘤生物学活性的有效指标，三者联合检测可明显提高PTC的诊断价值。