结肠癌患者MMR蛋白表达情况及临床病理特征

高瑞梓，杜正华，陈乐，郭源，张龙，李纪鹏

（1.西安医学院研究生院 外科学专业，陕西 西安 710068；2.中国人民解放军空军军医大学第一附属医院 消化外科，陕西 西安710068）

0 引言

结肠癌是一种地域差异显著的恶性肿瘤[1]，其发病和死亡负担与区域经济发展和生活、饮食习惯密切相关。作为结肠癌发生的第二大分子途径，由dMMR/MSI-H产生的结肠癌约在未筛选的结肠癌中占比20%左右，其中四分之一来自MMR基因种系突变所引发的遗传综合征（Lynch综合征），而在散发型患者中，dMMR/MSI-H也被发现与部分患者的化疗和免疫治疗反应及预后密切相关[2]。然而dMMR发生频率在不同地区和人种间差异显著[5-12]，为了探索结肠癌dMMR频率的分布情况和dMMR/MSI-H表型患者的临床特征，本文回顾性分析1279例结肠癌患者MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达缺失频率及dMMR与结肠癌肿瘤病理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究收集2010年1月至2017年12月于中国人民解放军空军军医大学第一附属医院西京医院消化外科接受手术治疗的结肠癌患者资料1351例，经过筛选，将其中符合纳排标准的1279例患者纳入研究。纳入标准：（1）接受根治性结肠癌手术治疗；（2）术后经病理科确诊为结肠癌。排除标准：（1）免疫组化或临床病理资料不完整；（2）接受任何术前放化疗或其它抗肿瘤治疗者。所有患者均已签署知情同意书。

1.2 方法

采用免疫组化IHC法检测4种MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）表达情况 ，取术中切除新鲜标本，常规10%福尔马林固定，石蜡包埋，选择代表性区域4μm连续厚切片，使用BOND-Max全自动免疫组化仪（美国 Leica 公司）按各抗体优化执行程序自动完成烤片、脱蜡、EDTA溶液高压热修复抗原、标记一抗、标记二抗、DAB显色和苏木素复染全流程，取出切片，用温和洗涤液清洗，并用乙醇及二甲苯脱水、透明、封片。主要试剂：鼠抗人hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2单克隆抗体，均购自福州迈新生物技术开发公司。

所有切片标本均在光镜下检查，并由空军军医大学第一附属医院西京医院病理科至少两名有经验的病理科医师进行独立判读。依据免疫组化染色半量化标准，抗体核染色阴性者为相应蛋白表达缺失，核染色阳性者为相应蛋白表达完整。任何1种或1种以上MMR蛋白表达缺失则判定为MMR蛋白表达缺失（dMMR），并分入dMMR组，无MMR蛋白表达缺失则判定为MMR蛋白表达正常（pMMR），并分入pMMR组。

1.3 统计分析

本研究采用PASW Statistics 18.0进行统计学分析。计数资料采用频数和百分比描述，符合正态分布的计量资料采用均数和标准差描述，采用t检验、χ2检验及Fisher精确检验分析临床病理特征的统计学差异，并认为P＜0.05即差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MMR蛋白表达情况

1279 例结肠癌患者dMMR率分布情况如表1所示，总体dMMR率为22.0%（282/1279），其中MLH1蛋白缺失率为 7.2%（92/1279），MSH2蛋白缺失率为5.6%（72/1279），MSH6蛋白缺失率为7.0%（90/1279），PMS2蛋白缺失率为15.5%（198/1279），同时存在MLH1+PMS2蛋白联合缺失，频率为7.0%（90/1279），MSH2+MSH6蛋白联合缺失，频率为4.9%（63/1279）。

表1 MMR蛋白表达情况

2.2 MMR蛋白表达与临床病理特征的相关性

1279 例结肠癌患者中，282例dMMR患者与997例pMMR患者比较，年龄更小（55.65%±15.48 vs 60.81±12.96，P＜0.001）。TNM分期方面，dMMR患者中Ⅱ期患者的比例显著高于pMMR患者（64.5% vs 40.8%，P＜0.001），而Ⅲ、Ⅳ期患者的比例明显低于pMMR患者（22.7% vs 42.9%，P＜0.001；3.9 vs 8.6%，P＜0.001）。dMMR患者肿瘤位于右半结肠的比例显著高于其在pMMR患者中的比例（65.6% vs 41.0%，P＜0.001）。大体类型方面，dMMR患者中肿瘤呈隆起型生长的患者所占比例显著高于pMMR患者（22.7% vs 16.6%，P=0.017），而呈浸润型生长的患者所占比例则明显低于pMMR患者（1.8% vs 4.1%，P=0.017）。在dMMR患者中，肿瘤呈低分化的患者所占比例显著高于pMMR患者（36.9% vs 16.3%，P＜0.001），而呈中分化的比例则明显低于pMMR患者（55% vs 76.5%，P＜0.001）。与pMMR患者相比，dMMR患者的肿瘤最长径更长（6.07±2.49 vs 4.63±1.93，P＜0.001）。且与pMMR患者相比，dMMR患者中N0和M0的患者占比较多（75.2% vs 49.6%，96.1% vs 91.4%，P均 ＜0.05）。T分期和性别在dMMR与pMMR结肠癌患者的比较中没有明显差异。发病年龄更小、分化不良更多见、位于右半结肠的比例更高、更倾向于呈隆起型生长而不是浸润型生长、肿瘤最长径更长、淋巴结转移和远处转移率较低且TNM分期更早，差异均有统计学意义，P＜0.05。T分期与性别在两组患者间没有明显差异。具体如表2所示。

表2 MMR蛋白表达与临床病理特征的相关性

3 讨论

作为消化系统最为常见的恶性肿瘤之一，结直肠癌2020年全球新发病例将超过190万人，死亡病例预计约93.5万人，占全球癌症新发病例和死亡人数的大约10%[13]。根据以往的研究，结直肠癌发病率的地域差异非常显著，世界各地区结肠癌发病率的差异高达9倍，发病率最高的地域主要集中于欧洲部分地区、澳大利亚/新西兰和北美，而中南亚与大部分非洲地区结直肠癌的发病率往往较低[2]。在由于经济发展和生活习惯的改变，我国结肠癌负担正快速增长，2015年新发病例数均居于第五位[14]，而2020年已跃居第二位，仅次于肺癌[13]。且在地域分布上也同样出现了经济发达地区相比欠发达地区更高发的特点[14]。

作为结肠癌发生的第二大途径，dMMR/MSI-H通路的分子基础是由于各种遗传因素和理化因素的损害所致的MMR基因种系突变或体细胞系甲基化，使MMR蛋白表达缺失，MMR功能也随之丧失，即dMMR。由于微卫星本身是遍布在基因组中的重复的核苷酸序列片段，尤其容易因DNA聚合酶滑移而出现碱基异常插入或移除，并出现重复次数（长度）变化[15]。正常情况下，每一种特定的微卫星原则上在同一个体的所有细胞中都应该是长度相同的，而dMMR时，一部分长度异常缩短或延长的微卫星序列无法被MMR系统修复，这就是微卫星不稳定状态（MSI）。这些不稳定的微卫星序列伴随有丝分裂传递给子代细胞进而大量累积，逐渐使基因组的稳定性丧失，进入高突变状态，最终导致恶性肿瘤的易感性大幅上升。有研究发现，一些微卫星位点本身的多态性可能与人种关系密切，比如微卫星BAT26在99%以上的白种人中长度统一，即为单态的，而在25%的非洲人种（包括非裔美国人）中出现多种长度不同的等位基因，即为多态的[16]。这也可能是导致dMMR/MSI-H表型结肠癌出现明显地域性差异的原因之一。

在以白种人群体为主要样本的研究中，dMMR/MSI-H率为20%-30%，西班牙人群体相对较低，De Jesus-Monge等报道为4.3%，亚洲地区报道为10%-15%[5-12]，本研究结果显示dMMR率为22.0%（282/1279），具体如表3所示，本研究总体上与国外研究接近但与国内报道相比偏高，究其原因可能与几个方面有关。

一方面由于各研究使用的检测方法有区别，一般认为，PCR法作为诊断金标准更加精确，但是由于IHC法成本更低，操作简便，可以在大多数病理部门进行，目前应用更加广泛。与PCR法相比，IHC法最突出的优势在于对靶基因的定位，由于dMMR与MSI-H存在因果关系，直接检测MMR蛋白可以提示引起MSI-H的具体突变基因。目前国际上，多数专家共识建议以PCR法进行预先检测，在结果不明确或不可用时再进行PCR检测[17-18]。事实上，在近些年的研究中，单独使用PCR法检测MSI的比例已由52%减少至20%左右[19]。在敏感度和特异度方面，有报道证明IHC法与PCR法总体接近，一致性范围可高达90.4%至99.6%[20]。也有报道IHC法预测MSI状态的准确率为76%，特异度为100%[21]。可见IHC法检测dMMR与PCR法检测MSI结果依然有一定的偏差，也许是由于比起PCR法，IHC法更依赖于病理医师，标本、固定、染色、判读等技术原因。这可能是本研究结果相比国内其他报道偏高的原因之一。

另一方面，研究者出于不同研究目的，选择的样本群体也有不同，一部分研究严格筛选并排除了具有阳性家族史的患者，而本研究由于缺乏详细遗传学资料未对样本进行筛选。既往的研究认为Lynch综合征患者绝大多数为dMMR/MSI-H表型，并且遗传性结肠癌中Lynch综合征的占比非常大[20]，显然排除遗传性结肠癌后dMMR/MSI-H频率将随之降低，本研究结果高于针对散发性病例报道也支持这一理论。

更值得注意的是，目前的大多数研究中将结肠癌与直肠癌样本一同纳入研究，事实上，结肠与直肠本质上是不同的器官，二者的胚胎学起源、解剖结构、生理功能上均不相同，结肠癌与直肠癌的发病率、死亡率、分子基础、临床特征、治疗反应和预后也存在差异[22]，Korphaisarn等[8]等报道结肠癌发生dMMR/MSI-H的频率显著高于直肠癌 (20.4% vs 7.6%，P=0.01)。Ye等[10]的研究也证明了结肠癌dMMR率明显更高（15.2% vs 5.1%，P＜0.01）。本研究针对结肠癌患者分析后发现了相比国内针对结直肠癌的报道更高的dMMR率，这也验证了上述规律。

此外，笔者注意到目前国内研究报道多半集中在北京、福建、广东等华北及东南沿海地区，而本中心患者主要来源于中西部地区，因此本研究结果也在一定程度上可以为dMMR率的地域性差异提供参考。

本研究结果显示4种MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的缺失率分别为7.2%、5.6%、7.0%和15.5%，同时MLH1+PMS2蛋白联合缺失率7.0%，MSH2+MSH6蛋白联合缺失率4.9%。总体与以往报道相接近，但PMS2缺失率较高，目前关于PMS2的研究较少，有学者报道PMS2蛋白缺失者发生远处转移的比例更小[12]，但具体机制仍不明确。此外，还可能与检测方法、结果判读、地域差异、结肠与直肠的差异有关，仍需进一步探索。

由于与Lynch综合征具有相似的分子基础，许多研究认为dMMR /MSI-H表型结肠癌患者总体上倾向于出现与Lynch综合征相似的临床特征[23]。本研究结果显示与pMMR组相比，dMMR组患者总体上出现了年龄更小、更好发于右半结肠、肿瘤分化程度较低、最长径较长、更倾向于隆起型、且分期较早、淋巴结侵犯和远处转移较少等临床特征，与文献报道基本相符，这一结果表明dMMR表型结肠癌的肿瘤生物学行为倾向于类似Lynch综合征的表现。

值得注意的是，本研究显示dMMR频率在各分期分布不同（Ⅰ期 24.8%、Ⅱ期 30.9%、Ⅲ期 13%、Ⅳ期 11.3%），Ⅳ期dMMR频率与总体相比明显降低（11.3% vs 22%），事实上，关于IV期结肠癌患者dMMR率的数据很少，大部分来自小样本研究，报道范围在0.5 - 21%之间，2018年Baretti等报道，dMMR/MSI-H表型仅占转移性CRC的4%[24]，Ⅳ期患者dMMR率低提示了dMMR/MSI-H表型结肠癌的转移侵袭能力可能较低，这可能说明了dMMR /MSI-H分子途径在肿瘤发生发展的不同时期扮演了不同的角色。本研究结果支持这样的假设，原因目前仍需要探索，有研究者认为，这可能与dMMR时一些编码区微卫星突变，导致终止密码子提前出现并产生无功能的截短蛋白有关，这些蛋白质对于患者的免疫系统而言是一种新的抗原，因此dMMR/MSI-H表型患者具有高免疫性的特点，得到免疫保护的可能性增加[25]，这也许是转移能力减弱的原因之一。

需要看到的是，由于dMMR发生率在人群中较低，在Ⅳ期可能尤其低，纳入研究的样本数量不足以支撑我们得出可靠的结论，这一现象仍需要后续研究的补充和验证。

依据本研究可得出结论：（1）结肠癌患者dMMR率约为22%，且在各期分布不同（Ⅰ期24.8%、Ⅱ期30.9%、Ⅲ期13.1%、Ⅳ期11%）。（2）dMMR表型结肠癌具有年龄更小、更好发于右半结肠、分化不良更多见、肿瘤最长径较长、更倾向于隆起型、且分期较早、淋巴结侵犯和远处转移较少等临床特征。为结肠癌的诊断分类与dMMR/MSI-H通路的探索提供新的参考。目前仍存在一些不足：（1）由于缺少详细的家族史，未能进一步区分散发性与遗传性结肠癌进行分析；（2）下一步可继续扩大样本量并纳入随访资料探索dMMR表型结肠癌的预后特征。