宁夏地区玉米镰孢茎腐病病原菌的分离与鉴定

张小杰， 王春明， 周天旺， 刘 浩， 沈瑞清， 李敏权*， 郭 成,*

(1.甘肃农业大学植物保护学院， 甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省农业科学院植物保护研究所， 甘肃 兰州 730070；3.宁夏农林科学院植物保护研究所， 宁夏 银川 750002)

玉米(ZeamaysL.)是我国重要的粮饲兼用型作物和能源植物，在国民经济中占有重要地位[1]。宁夏作为我国的主要玉米产区之一，素有西部玉米“黄金产业带”之美誉，因其日照充足及积温值高、昼夜温差大、气候较温凉的独特气候条件，使得玉米籽粒饱满、品质优良，单产水平远高于全国平均水平[2]。自2010年以来，玉米已成为宁夏的第一大粮食作物[3]。但近年来，由于全球气候变暖，秸秆还田[4]和高密度种植技术的大力推广，种植模式由套种模式逐步向单作玉米的转变[3,5]，使得宁夏地区的玉米茎腐病呈逐年加重的趋势。

玉米茎腐病是一种世界性的土传病害，年度间产量损失在10%～30%[6]。病菌单独或复合侵染可导致茎腐病的发生，使得养分和水分流失，导致作物减产，同时茎秆纤维受损引起植株倒伏[6]。目前已报道玉米茎腐病的病原菌有20余种[7]，国外研究表明，在美国该病是由玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodiamaydis)、禾生炭疽菌(Collectotrichumgraminicolum)、胶孢镰孢(Fusariumsubglutinans)和禾谷镰孢(F.graminearum)等多种病原菌所致[8]，在西欧国家玉米茎腐病的主要致病菌是拟轮枝镰孢(F.verticillium)和玉米穗粒干腐菌(Diplodiazeae)，东欧地区的是禾谷镰孢[9]，俄罗斯和乌克兰也以禾谷镰孢为主。在气候炎热的热带国家，如印度、尼泊尔、孟加拉国、菲律宾、泰国、以色列、南非和希腊，玉米茎腐病主要由细菌欧文氏菌(Erwinia)引起[10]。我国幅员辽阔，不同地区气候及环境等条件差异大，致使各玉米产区茎腐病病原菌种类多样，且优势致病菌种群差异较大，如河北、陕西及东北三省等较干旱的省份镰孢菌易成优势菌群[11]。郭成[12]通过对甘肃省4大生态区玉米茎腐病病原菌进行鉴定发现，禾谷镰孢复合种(F.graminearumspecies complex)和拟轮枝镰孢为当地的优势病原菌；刘树森等[13]研究发现黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌为拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、芒孢腐霉(Pythiumaristosporum)和层出镰孢(F.proliferatum)，其中拟轮枝镰孢为优势种且在河北省的检出率最高，层出镰孢和芒孢腐霉在山东省的检出率最高，禾谷镰孢复合种在河北、河南和山东3省的检出率相近；贺娟等[14]报道禾谷镰孢和拟轮枝镰孢是云南省玉米茎腐病的优势种群；陈楠等[11]提出引起东北地区玉米茎腐病的致病镰孢菌主要为拟轮枝镰孢和禾谷镰孢；张超冲等[15]研究指出，广西地区玉米茎腐病病原菌以串珠镰孢(F.moniliforme)为主，禾谷镰孢分离频率较低；山西省的优势病原菌除串珠镰孢外还有胶孢镰孢[16]。镰孢菌种类繁多，在形态上难以区分，给相关病害的诊断造成了很大的困难。根据形态特征，可参考Nelson和Leslie等分类系统对分离菌株进行初步鉴定。其中，Nelson系统对于种的概念较为清晰，较好的分析了各个种的重要特征及近似种间的区别，对镰孢菌的分类比较具有重要的参考价值[17]。此外，该系统还增加了康乃馨叶片琼脂(Carnation leaf-piece agar，CLA)培养基，该培养基能促进分生孢子梗和分生孢子大量产生，且与自然情况下的形态极其相似[18]。随着分子生物学技术的不断发展，基因序列分析等技术在真菌分类上的应用，使得镰孢菌属真菌分类更准确，尤其转录延伸因子(EF-1α)的分子进化过程与生物物种的整体进化过程一致，对亲缘关系较近的种分辨率高，可以较好地表现镰孢菌在种一级的关系[11]。

在当今农村劳动力日趋紧张,需迅速普及推广机械化收获的情况下，茎腐病已成为制约宁夏地区玉米持续增产的重要因素。该病害的防治以种植抗性品种和种子包衣为主，两种防治技术的研究和推广均建立在明确病原菌的研究基础上[13]，但关于宁夏玉米茎腐病的病原种类目前尚不清楚。因此，本研究在形态学鉴定的基础上，选取各个种的代表性菌株进行EF-1α测序，构建系统发育树，进一步验证传统形态学的鉴定结果，确定宁夏地区玉米镰孢茎腐病的病原菌种类和数量，是有效防治该地区玉米茎腐病的前提和基础。

1 材料与方法

1.1 病株采集

2020年9月8日至9月11日，在宁夏回族自治区玉米种植田中采集有明显症状的发病植株，共计36份。采集地点如表1所示。

续表1

1.2 病原菌分离

玉米茎腐病病原菌的分离方法：首先用无菌水将玉米茎基部冲洗干净，晾干后将病健交界处组织剪成约0.5 cm×0.2 cm的小块，采用组织分离法进行病原菌分离，获得分离物纯化后，再参考相关文献进行单孢分离[19]。经单孢分离获得纯化菌株后，将病菌分别转接于马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基和CLA培养基上进行培养[17-18]，根据培养性状进行形态学鉴定。

1.3 病原菌的种类鉴定

1.3.1形态学鉴定 镰孢菌的形态学鉴定主要参考Nelson[20]和Leslie[21]等分类系统，根据观察分离物在PDA培养基上形成的菌落大小及形态，CLA培养基上大、小型分生孢子和厚垣孢子的有无、特点以及产生方式等形态特征进行初步鉴定。

1.3.2TEF序列鉴定 在形态学特征鉴定的基础上，选取相对应种的代表性菌株，在PDA上培养3 d后，转移至铺有灭菌玻璃纸的PDA培养基上培养7 d后，刮取菌丝体用液氮进行速冻，充分预冷后在研磨机中研磨，采用上海生工生物工程技术服务有限责任公司试剂盒提取基因组DNA。

使用镰孢菌菌株种间鉴定的特异性引物TEF-F(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)，TEF-R(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)(引物由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成)[22]以30 μL体系进行PCR扩增。扩增后的产物送上海生工生物工程技术服务有限公司北京分公司测序部测序。

1.3.3系统进化分析 将测序结果与NCBI基因库中已登录的镰孢菌序列进行BLAST比对，统计比对结果。一个种选取2个菌株为代表，采用MEGA 7.0软件进行ClustalW比对后，以邻近相接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树。

1.4 致病性测定

选取不同种类的镰孢菌代表菌株接种于PDA培养基上活化，置于25℃黑暗条件下培养5 d后，转接至玉米粒培养基上，再培养7～10 d。选择直径10 cm的花盆，将土和蛭石以 1∶1(体积比)混匀灭菌后，每盆接种病原繁殖体40 g，使土壤带菌。玉米品种选用‘利合328’(为甘肃早熟春玉米类型区种植品种，感茎腐病)。挑选健康饱满的种子，用75%的酒精表面消毒5 min，无菌水冲洗3次，每个花盆播种10粒，重复5次。采用常规浇水等进行日常管理，待出苗20 d后开始记载发病状况，并计算发病率和平均病级。分级标准参考宋佐衡等[23]针对苗期玉米茎腐病调查提出的5级标准。

1.5 统计分析

采用Excel 2010软件进行数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定结果

根据Nelson和O'Donnell等人对镰孢菌属真菌的分类研究，进行形态学鉴定，可分为9种镰孢菌。各个种的形态学特征如下：

禾谷镰孢复合种：在PDA上产生玫瑰红色絮状气生菌丝，间有白色、浅黄色的菌丝团。小型孢子较少，呈卵圆形；大型分生孢子呈镰刀形，顶胞较尖呈鸟嘴状，3～8个隔膜，分隔明显(图1-A)。产孢梗为单瓶梗。厚垣孢子聚生或串生，球形或近球形，较光滑或略粗糙。

拟轮枝镰孢：在PDA上产生白色或淡紫色丛卷毛状气生菌丝，菌落背面随着培养天数的增加颜色变异比较大。小型分生孢子密集分布，形成或长或短的分生孢子链，0～1隔，卵形或棒槌形。大型分生孢子呈镰刀形，细长较直，3～5分隔。产孢梗通常呈现“V”字形，或出现“兔子耳朵”状，其分支一般不超过3个(图1-B)。

木贼镰孢(F.equiseti)：在PDA上产生絮状气生菌丝，比较致密平坦，菌落初期为白色至浅粉色，后逐渐变为土黄色。未观察到小型分生孢子，大型分生孢子呈镰刀状，细长弯曲，顶细胞细长且基细胞足跟比较明显，3～7隔。产孢梗为单瓶梗，梗较短，数量较少，不易观察到。通常在气生菌丝上产生大量串生的黄褐色厚垣抱子(图1-C)。

层出镰孢：在PDA上产生羊毛状的气生菌丝，菌落初期呈白色或淡紫色，菌落背面产生紫色色素。其分生孢子的形态特征与拟轮枝镰孢较为相似。产孢梗分支较多，单瓶梗和复瓶梗共存。常见为较长的产孢细胞旁边形成很短的产孢点，或形成“Z”形的复瓶梗(图1-D)。

胶孢镰孢：在PDA上气生菌丝常聚集成较明显的菌丝束，呈蛛网状，菌落颜色从白色到灰紫色或深紫色，其上有粉状物。其分生孢子的形态特征与拟轮枝镰孢较为相似。产孢梗分支较多，单瓶梗和复瓶梗共存，以复瓶梗较多(图1-E)。

半裸镰孢(F.incarnatum)：在PDA上产生羊绒状气生菌丝，菌落初期为浅粉色，后期变为黄褐色。小型分生孢子呈倒卵形或窄瓜籽形，串生或假头生；大型分生孢子较直，呈针叶形，顶细胞锥状，直或略弯曲，基细胞为一个小柄状，多为3～5个隔膜。产孢梗为单瓶梗和复瓶梗共存(图1-F)。

锐顶镰孢(F.acuminatum)：在PDA上产生玫瑰红色气生菌丝，较致密繁茂，菌落边缘不圆滑。小型分生孢子稀少，肾形，长椭圆形，绝大多数无隔，有的菌株产生，有的菌株不产生，以假头状着生；大型分生孢子细，中等长，稍弯，中间宽，3～5个隔膜，足胞不明显，两端渐尖。产胞细胞为单瓶梗(图1-G)。

黄色镰孢(F.culmorum)：在PDA上产生絮状气生菌丝，菌丝表面浅黄色，背面产生玫瑰红色素。未观察到小型分生孢子；大型分生孢子稍弯曲，梭形至镰刀形，0～6个隔膜，足胞有凹缺，顶胞钝圆或稍尖。产孢细胞单瓶梗(图1-H)。

燕麦镰孢(F.avenaceum)：在PDA上产生短羊毛状气生菌丝，中央少部分为浅紫红色，边缘白色，后期菌落背面产黄色色素。小型分生孢子呈卵形或棍棒形，0～1隔；大型分生孢子细长且直，呈线形，1～3个隔膜，顶胞逐渐变细弯曲。产孢细胞为单瓶梗(图1-I)。

2.2 病原菌分离结果

2020年从宁夏回族自治区采集的36份玉米茎腐病植株样本中，共分离得到209株镰孢菌，根据形态学鉴定，共分为9种镰孢菌(表2)。其中，禾谷镰孢菌复合种分离频率最高，为28.2%；拟轮枝镰孢和木贼镰孢次之，分离频率分别为23.9%和20.1%；剩余7种镰孢菌包括：层出镰孢、胶孢镰孢、半裸镰孢、锐顶镰孢、黄色镰孢和燕麦镰孢，其分离频率依次为8.1%，7.2%，6.7%，2.9%，1.9%和1.0%，均不足10%。从采集分离的地点来看，禾谷镰孢菌复合种、木贼镰孢、胶孢镰孢和半裸镰孢在宁夏5市均有分布，拟轮枝镰孢除在固原市没有分布外，其余4市均有分布，锐顶镰孢和燕麦镰孢仅在固原市有分布，黄色镰孢则仅在石嘴山市分离到。综合来看，宁夏地区玉米镰孢茎腐病优势致病菌为禾谷镰孢复合种。

图1 镰孢菌形态特征图

表2 宁夏地区玉米茎腐病镰孢菌的分离频率

2.3 病原菌的系统进化分析

经对选取的20个菌株的测序结果与NCBI基因库中已登录的镰孢菌EF-1α基因序列比对，利用MEGA7.0软件采用邻近相接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树(Bootstrap=1 000)，以匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)为外类群，三线镰孢(F.tricinctum)为内类群，发现1-1和12-2与GenBank已登录的布氏镰孢(HQ889160)聚在同一分支上，13-2和26-4与禾谷镰孢(KX269083,KX269100)聚在一起，禾谷镰孢与布氏镰孢位于同一分支，进化距离较短，亲缘关系较近，这与O'Donnell将禾谷镰孢与布氏镰孢等合称为禾谷镰孢复合种这一事实相符合[24]。28-1和28-4与黄色镰孢(GU370481,MK577954和MK577953)聚为一支；16-3和24-4与木贼镰孢(MH595501,KT213281和KP267452)聚为一支；15-2和31-7与半裸镰孢(MK328877,GQ339789和HQ165861)聚为一支；1-13和14-3与胶孢镰孢(MG826894,KM462951和JF270168)聚为一支；8-2和27-4与层出镰孢(KY435733和KT239490)聚为一支；17-1和35-3与拟轮枝镰孢(MT470921,MF803750和MH791038)聚为一支；3-4和1-12与燕麦镰孢(KP400697、MK185024和KY365607)聚为一支；7-7和6-10与锐顶镰孢(MH341216,MG826865和KC175292)聚为一支(图2)。通过对两种鉴定结果的分析比较表明，分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致。可将分离获得的镰孢菌分为9种，包括禾谷镰孢复合种、拟轮枝镰孢、木贼镰孢、层出镰孢、胶孢镰孢、半裸镰孢、锐顶镰孢、黄色镰孢和燕麦镰孢。

图2 基于EF-1α基因序列构建的不同镰孢菌种的系统发育树

2.4 致病性测定

选取所鉴定到的不同种类的镰孢菌代表菌株对玉米品种‘利合328’幼苗进行致病性测定，试验结果表明，供试菌株均能侵染玉米植株并引起茎基部不同程度腐烂变褐，且不同种类的镰孢菌致病力存在较大差异。其中，黄色镰孢的致病性最强，种子大多坏死，平均病情指数高达90以上。禾谷镰孢复合种致病性次之，发病率为100%且平均病情指数在75以上。与对照相比，发病植株生长矮小，茎部病斑变褐凹陷，扩展明显，严重的甚至腐烂坏死。层出镰孢、胶孢镰孢和锐顶镰孢致病性较弱，两者的发病率虽达到100%，但平均病情指数在45左右，其中，胶孢镰孢在引起植株发病的同时，还出现了一定程度的白化。拟轮枝镰孢、木贼镰孢、半裸镰孢和燕麦镰孢的致病性最弱，平均病情指数仅在20～30(表3)。

表3 盆栽法测定结果

3 讨论

不同地理、气候条件和土壤中微生态差异导致各地茎腐病病原菌的组成和优势种都不尽相同[6,13]。宁夏位于我国西北内陆，全区属温带大陆性干旱、半干旱气候，多年平均年降水量为183.4～677 mm，由南向北逐渐递减。依据地形可分为3大板块：南部山区、中部干旱带、北部引黄灌区。本试验从采集的病样中分离获得209株镰孢菌，由9种镰孢菌组成，禾谷镰孢复合种为主要致病菌，拟轮枝镰孢和木贼镰孢次之。本研究结果与河北[13]、河南[13]、甘肃[12]、陕西[25]和东北[11]等地区玉米茎腐病优势致病菌为禾谷镰孢和拟轮枝镰孢相一致，与广西省[15]玉米茎腐病优势菌为串珠镰孢、山西省[16]茎腐病优势菌为串珠镰孢和胶孢镰孢的结果有所差异,可能与不同地区气候类型和耕作栽培方式等不同以及病原菌生态适应型不同相关。由于从自然和农业生态系统中获得的镰孢菌具有不同的气候偏好[26]，气候甚至天气的局部变化都可以影响镰孢菌的范围及其相对频率。本研究中拟轮枝镰孢除在固原市没有分离到外，其余4市均有分布，这可能也与拟轮枝镰孢较喜欢相对温暖干旱的地区[18]有关。

对分离得到的59株禾谷镰孢复合种通过镰孢菌特异性引物EF-1α扩增后进行测序和Blast比对，共获得38株布氏镰孢(F.boothii)和21株禾谷镰孢，占比为64.4%和35.6%，由此可见，布氏镰孢为禾谷镰孢复合种的优势种群。该结论与郭成[12]研究发现甘肃省玉米茎基腐病优势种为禾谷镰孢复合种，且布氏镰孢和禾谷镰孢的比例为2.75∶1的结果基本一致。从采集分离的地点来看，禾谷镰孢在固原市、中卫市、吴忠市、银川市和石嘴山市均有分布，分离频率分别占禾谷镰孢总数的4.76%，4.76%，14.29%，61.90%和14.29%;布氏镰孢除在石嘴山市未分离到外，其在固原市、中卫市、吴忠市和银川市均有分布，分离频率分别占布氏镰孢总数的63.16%，26.32%，7.89%和2.63%。分析发现布氏镰孢多在宁夏南部分布，禾谷镰孢多在北部分布，但两者在中部干旱带也均有分布，这可能是因为：宁夏南部山区相对潮湿，畜牧业发达，主要种植青贮玉米；中部干旱带，种植业与畜牧业并存[27]；北部引黄灌区则相对干旱平坦，大面积连片种植普通玉米。

本研究首次明确了宁夏地区玉米镰孢茎腐病病原菌的种类以及优势病原菌为禾谷镰孢复合种，为该地区玉米茎腐病的防治提供了理论依据。但我们仍需对优势致病菌的遗传多样性、快速检测方法的构建及综合防治措施等方面进一步做深入研究。

4 结论

本研究明确了宁夏地区玉米镰孢茎腐病的病原菌种类由禾谷镰孢复合种、拟轮枝镰孢、木贼镰孢、层出镰孢、胶孢镰孢、半裸镰孢、锐顶镰孢、黄色镰孢和燕麦镰孢组成，其中禾谷镰孢复合种的分离频率最高，为宁夏玉米镰孢茎腐病优势病原菌。