砂仁精油对紫花苜蓿青贮品质的影响

陈德奎， 郭 香， 郑明扬， 陈晓阳, 周 玮， 张 庆

(广东木本饲料工程技术研究中心， 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室， 广东 广州 510642)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一种营养丰富、适口性好且在世界范围内广泛种植的一种适应性良好的优良的豆科牧草，享有“牧草之王”的美称[1-2]。紫花苜蓿的粗蛋白质(Crude protein,CP)含量丰富，优质紫花苜蓿的蛋白质含量可达18%以上[3]。除此之外，紫花苜蓿中还富含矿物质元素[4]。青贮饲料是厌氧发酵的产物，是有效保存牧草的方式之一，能够有效克服外界环境对牧草营养物质的破坏[1]。因此，对紫花苜蓿进行青贮保存是一种避免紫花苜蓿营养损失的有效途径。然而，由于紫花苜蓿的高缓冲性能和低干物质(Dry matter,DM)含量，在青贮过程种紫花苜蓿青贮的pH通常维持在一个较高水平，无法抑制梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌和肠杆菌等不良微生物的生物活动，从而造成紫花苜蓿青贮腐败变质[5]。因此，抑制紫花苜蓿青贮过程中的有害微生物的生长和繁殖是提升青贮品质的有效途径。

植物精油是从植物根茎叶中提取的具有广谱抗菌活性的具有芳香气味的液体[6]。在食品加工中，植物精油常作为天然防腐剂来抑制致病菌的生长从而延长产品的货架期[7]。植物精油对致病性大肠杆菌(EscherichiacoliO157:H7)、金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphimurium)等食源性致病菌的抑菌活性较强[8]。在动物饲料中添加植物精油，有益于动物健康的改善和生产性能的提高。在猪和家禽饲料中适当添加植精油可以使其体重、饲料采食量和饲料转化率得到改善，并且能够提高畜禽的免疫能力[9]。有研究表明，在反刍动物瘤胃中添加植物精油能够有效改善瘤胃发酵内环境、调节微生物菌群并提高青贮饲料利用率[10-12]。此外，植物精油对青贮中的不良微生物(酵母菌，梭状芽孢杆菌，串珠镰刀菌)也有着不错的抑制效果，并对嗜酸乳酸杆菌的生长具有一定的促进作用[13]。然而，在青贮中添加植物精油的研究却比较少。

砂仁(AmomumvillosumLour.)是中医中常用的一味芳香性药材，具有清热解暑、行气、消胀等保健功能[14]。砂仁精油(AmomumvillosumLour. essential oil,AVEO)主要成分为烯类、酯类和醇类，由于AVEO具有广谱的抗菌活性，不仅可以作为抗菌药物用于临床，也可以作为天然防腐添加剂应用于食品加工行业[15-16]。

因此，本研究旨在探索AVEO抑菌活性对紫花苜蓿青贮品质以及营养品质的影响，从而筛选出适宜的砂仁精油添加量，为丰富青贮添加剂资源库提供理论支持，为砂仁精油在青贮领域的应用提供实践依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

第2茬初花期紫花苜蓿原料刈割自华南农业大学启林北试验田。AVEO购自阳江市百盛实业有限公司。

1.2 试验设计

将新鲜的紫花苜蓿原料用铡刀切割成1～2 cm，并搅拌均匀。分别将等量的0.5% AVEO，1% AVEO和蒸馏水均匀喷洒在原料上，蒸馏水处理的设为对照组(CK)。然后将处理后的原料混合均匀后装到聚乙烯密封袋(20 cm×30 cm)中，每袋大概100 g，并用真空密封机抽出密封袋中的空气并密封。将密封好的青贮饲料放置在室内(27～30℃)保存。在15 d和30 d开袋取样并对青贮发酵品质及化学成分进行分析。试验一共设计3个处理，每个处理6个重复，一共18袋。分两次开袋，每次每个处理取3个重复。

1.3 青贮品质及微生物群落分析

1.3.1发酵品质分析 开袋后，随机取10 g青贮样品，并加入90 mL无菌蒸馏水均匀混合，在—4℃的冰箱中冷冻保存18 h。随后用4层纱布和中速定性滤纸过滤，滤液用于测量pH、有机酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)和氨态氮(Ammonia nitrogen,NH3-N)含量。用pH计(PHS-3C，上海雷磁)测定样品的pH值。用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N的含量[17]。按照He等[18]试验方法，使用高效液相色谱仪测定有机酸的含量。

1.3.2微生物数量测定 另取10 g青贮样品，与90 mL无菌生理盐水(0.85% NaCl)均匀混合，并用4层纱布过滤，取滤液。将滤液从10-1～10-6逐级稀释。乳酸菌和大肠杆菌分别接种在MRS琼脂培养基(环凯生物科技有限公司，广州)和结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(VRBA；环凯生物科技有限公司，广州)中，并在30℃厌氧培养箱中培养48 h。酵母菌和霉菌接种在孟加拉(虎红)红培养基(环凯生物科技有限公司，广州)中，并在28℃生化培养箱中培养48 h。采用平板计数法测定微生物数量，并将微生物数量转化为Lg表示。

1.3.3营养成分分析 将剩下的约80 g青贮样品称重后，放置在65℃的烘箱中干燥48 h除去水分，测定DM含量。然后将烘干的样品粉碎并过1 mm筛，粉样用于测定CP和真蛋白(True protein,TP)。采用全自动凯氏定氮仪(Kjeltec 8400,FOSS,丹麦)分析CP。按照Licitra等[19]人的方法测定TP的含量。非蛋白氮(Non-protein nitrogen,NPN)的含量计算如下：

WNPN=WCP- WTP

除此之外，用A220纤维分析仪(ANKOM科技公司，美国纽约州马其顿)测量中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber,ADF)的含量。用硫酸-蒽酮比色法测定水溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates,WSC)的浓度[20]。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0中双因素方差分析(Two-way AVOVA)对紫花苜蓿发酵参数和蛋白质分数进行了分析。显著性差异采用Duncan多重极差检验，当P<0.05时，表示为显著。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿原料的特性

如表1所示，紫花苜蓿原料中DM含量为299 g·kg-1FM，CP含量为141 g·kg-1DM。DM中纤维含量占比较大，NDF含量为467 g·kg-1DM，ADF含量为341 g·kg-1DM；WSC浓度较低，浓度为33.2 g·kg-1DM。外附微生物较丰富，乳酸菌数量为6.68 lg cfu·g-1FM，大肠杆菌数量为6.25 lg cfu·g-1FM，酵母菌和霉菌数量分别为5.06 lg cfu·g-1FM和4.37 lg cfu·g-1FM。

表1 紫花苜蓿原料的营养成分及微生物群落数量

2.2 紫花苜蓿青贮发酵品质分析

AVEO对紫花苜蓿发酵品质和微生物数量的影响如表2所示。在青贮第30 d，添加0.5% AVEO和1% AVEO均显著提高了紫花苜蓿青贮的DM含量(P<0.01)；与DM含量提高一致的是，添加0.5% AVEO和1% AVEO也使紫花苜蓿的干物质回收率显著提高(P<0.01)。在AVEO的作用下，紫花苜蓿青贮的pH值显著降低(P<0.01)。青贮时间的延长也显著降低了pH值(P<0.05)。同时在0.5% AVEO和1% AVEO处理中，青贮时间延长显著降低了乳酸菌的数量(P<0.05)。在青贮第15 d，1% AVEO显著降低了大肠杆菌的数量(P<0.05)，随着青贮时间的延长大肠杆菌数量显著降低(P<0.01)。AVEO与青贮时间的交互作用对紫花苜蓿青贮发酵品质和微生物组分无显著影响。随着青贮时间的延长乳酸的积累量显著增多(P<0.05)。在青贮的第30 d，用1% AVEO精油处理的紫花苜蓿青贮乳酸含量显著增多(P<0.05)。与乳酸增加相似的是，乙酸的含量也随着青贮时间延长显著增加(P<0.05)。

表2 AVEO对紫花苜蓿发酵品质和微生物数量的影响

2.3 紫花苜蓿青贮营养成分分析

紫花苜蓿青贮蛋白质组分分析结果如表3所示。结果表明，时间和AVEO处理对紫花苜蓿的粗蛋白含量均无显著影响。与CK相比，添加0.5% AVEO在青贮第30 d提高了TP的含量，1% AVEO在青贮第15 d和第30 d均显著提高了紫花苜蓿青贮的TP含量(P<0.05)。随着青贮时间的延长，TP的含量显著减少了(P<0.05)，NH3-N的含量也随之显著提高(P<0.01)。AVEO与青贮时间的交互作用对紫花苜蓿青贮蛋白质组分无显著影响。

表3 紫花苜蓿青贮的蛋白质组分

3 讨论

3.1 紫花苜蓿原料特性

本研究中紫花苜蓿原料DM含量为299 g·kg-1FM，属于高水分牧草，有利于梭状芽孢杆菌等腐败微生物的发酵，难获得发酵品质高的青贮饲料[21]。紫花苜蓿原料CP含量为141 g·kg-1，低于李菲菲[22]、于浩然[23]和罗颖洁[24]等人报道的18%～23%，这可能与牧草生长的气候、地理位置以及刈割时期有关。

牧草附着的乳酸菌能够将WSC通过同型发酵转化为乳酸，是保证青贮发酵品质良好的重要条件[25]。紫花苜蓿原料的外附乳酸菌数量为6.68 lg cfu·g-1FM，高于良好发酵对乳酸菌数量要求的理论值5.0 lg cfu·g-1FM，有利于青贮发酵[26]。

3.2 AVEO对紫花苜蓿发酵品质影响

pH值是衡量青贮发酵过程优劣最直观的指标。青贮pH值的降低主要归因于乳酸菌将WSC转化为有机酸[27]。青贮30 d后，用0.5% AVEO和1%AVEO处理的紫花苜蓿青贮的pH值分别为4.91和4.89，均不能达到发酵良好的理论pH值4.2[27]。这与WSC(33.2 g·kg-1DM)含量较低有关，WSC的含量高于50 g·kg-1DM是保证发酵品质良好的阈值，尤其是在高水分青贮中，高水分会稀释WSC的浓度并降低pH的下降速率为有害微生物的增长创造条件[28-29]。万里强[30]和李艳芬[31]等人也报道了在不做任何处理的情况下，紫花苜蓿中低WSC含量会导致紫花苜蓿青贮的高pH值。与CK相比，添加1% AVEO紫花苜蓿青贮乳酸的含量在青贮第30 d从12.0 g·kg-1DM增加到了13.0 g·kg-1DM(P< 0.05)，随着乳酸含量的增多紫花苜蓿青贮的pH值从5.05下降到了4.89。乳酸的累积量增多可能是精油广谱的抑菌活性抑制了大肠杆菌等不良微生物的代谢乳酸的能力[8,13,27]。在青贮的第15 d，添加1% AVEO的紫花苜蓿青贮中大肠杆菌受到抑制，数量从5.79 lg cfu·g-1FM下降到了4.29 lg cfu·g-1FM(P<0.05)。这与Tsurumi等人[32]报道一致，其研究表明AVEO对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和绿脓杆菌均有显著的抑菌作用。与青贮第15 d相比，青贮第30 d乙酸含量在CK，0.5% AVEO和1% AVEO组中显著增加。紫花苜蓿原料的酵母菌数量5.06 lg cfu·g-1FM，然而在紫花苜蓿青贮中未检测到酵母菌，这可能与乙酸对酵母菌有较强的抑制作用有关[25]。本研究中未检测到丁酸，表明紫花苜蓿发酵品质良好，不良发酵较少。青贮30 d后，0.5% AVEO和1%SERO处理的紫花苜蓿青贮干物质的回收率分别从95.3%显著提高到98.6%和103%，意味着紫花苜蓿青贮可供动物消化的养分含量提高了，在生产上能带来巨大的经济效益。

3.3 AVEO对紫花苜蓿营养品质的影响

在青贮过程中，真蛋白的水解主要有两条途径：一是不良微生物分泌蛋白质水解酶促进蛋白质肽键的水解、多肽和氨基酸的脱氨；二是植物自身的蛋白质水解酶促进蛋白质的水解[21]。真蛋白的水解会直接导致NPN和NH3-N含量的增加，降低青贮的营养价值[33]。反刍动物对NPN的利用效率远低于TP，因此TP的保存效果也决定着青贮饲喂价值[27]。在本研究中，在青贮30 d后，添加了0.5% AVEO和1% AVEO的紫花苜蓿青贮的TP含量分别从54.4 g·kg-1DM显著提高到了57.9 g·kg-1DM和59.9 g·kg-1DM (P<0.05)。同时，与CK相比添加AVEO的紫花苜蓿青贮中NPN和NH3-N的含量有所降低。据Muck[25]报道，厌氧型大肠杆菌会促进青贮的腐败变质。本研究中，添加1%AVEO对大肠杆菌显著的抑制效果可能是紫花苜蓿青贮蛋白质品质显著提高的主要原因。随着青贮时间的延长，NH3-N含量显著提高(P<0.01)，紫花苜蓿青贮的蛋白质品质下降，这可能是由于发酵过程破坏植物细胞生物膜结构，造成植物自身蛋白酶外渗所引起的蛋白质水解[26]。在不同的青贮材料中，陶莲[34]、郭金桂[35]和姜俊芳[36]等人均在青贮的动态研究中发现，青贮时间与氨态氮含量呈正相关关系。

4 结论

本研究结果表明，添加AVEO精油显著降低了紫花苜蓿青贮的pH值，提高了乳酸含量、干物质回收率和真蛋白的含量，增强了蛋白质的营养效价。在紫花苜蓿中添加1% AVEO有助于改善青贮的发酵品质和营养品质。