不同添加剂对高水分全株玉米青贮饲料发酵品质和细菌群落的影响

陆永祥， 严显明， 周朝相， 朱会先， 苟文龙， 游明鸿， 李达旭， 陈仕勇，李 平*, 白史且*

(1. 西南民族大学, 四川 成都 610041； 2. 会东县黑山羊研究所， 四川 会东 615200； 3. 四川省草原科学研究院， 四川 成都 611731)

青贮玉米(ZeamaysL.)，尤其是青贮后的全株玉米因其能值高、易消化、适口性好等优点，已成为反刍家畜日粮中主要有效成分，也是我国“粮改饲”的主推作物之一[1-2]。此外，发展全株玉米青贮还能够解决当前青饲作物产能不足的问题，增加农民收入[3]。然而，全株玉米的青贮品质受很多因素影响，水分是影响其青贮品质的一个重要因素[4]。四川省属于亚热带季风气候地区，夏季多雨阴湿，农业机械化程度较低，收获的全株玉米青贮时水分含量较高，而原料水分过高易造成腐败，导致青贮饲料品质下降[5]，不利于全株玉米青贮饲料的推广与利用。

许多研究已证明，选择合适的添加剂可以提高高水分饲草料青贮的发酵品质[6]。目前，青贮添加剂按组成可分为微生物和化学添加剂，而乳酸菌制剂和无机盐则是这2类常用的添加剂[7-8]。此外，青贮饲料发酵品质的好坏受其所含微生物的种类以及它们代谢活动的影响，了解微生物的活动规律对于改善青贮饲料的发酵品质具有重要意义[9-10]。因此，本试验以全株玉米为研究对象，通过添加植物乳杆菌和苯甲酸钠来探究不同添加剂对高水分全株玉米青贮饲料发酵品质和细菌群落组成的影响，以期为该区域后期全株玉米的青贮研究提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 青贮调制

本试验在成都四川省草原科学研究院韩场实验基地(30°27′N，103°43′E，海拔502 m)进行。本试验选取乳熟期的全株玉米作为青贮原料，将青贮原料按1～2 cm的理论长度切碎，切碎后的青贮原料随机分成3等份，用于以下处理：(1)对照(CK)；(2)添加植物乳杆菌制剂(LP，由四川省草原科学研究院提供，菌株编号BT12；添加量为1×106cfu·g-1FM)；(3)添加苯甲酸钠(BS，添加量为0.1% FM)，每种处理设置3个重复。再利用青贮打捆包膜机(ST5552A，山东圣泰机械制造有限公司，山东，中国)制成小捆青贮饲料(0.52 m×0.55 mø；密度约为55 kg·hm-3Fresh weight,FM)，在室温环境下贮存60 d。

1.2 营养成分测定

将青贮样品放置于65℃的烘箱中烘干至恒重后测定其干物质(dry matter,DM)含量[11]，然后将样品通过1 mm筛子研磨以进行其他营养成分分析。利用凯氏定氮法测定粗蛋白(crude protein,CP)含量[12]，使用Ankom 2000纤维分析仪(Ankom Technology，Fairport，NY)测定中性洗涤剂纤维(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗涤剂纤维(acid detergent fiber,ADF)含量[13]，可溶性碳水化合物含量(water soluble carbohydrate,WSC)则通过蒽酮-硫酸比色法测定[14]。

1.3 发酵指标测定

在Stomacher搅拌机中将20 g的新鲜样品与180 mL超纯水混合3 min，4层无菌纱布过滤后，用pH计测定滤液的pH值。将滤液(约10 mL)离心(4 500 g，15 min，4℃)，并采用高效液相色谱法分析上清液中的乳酸(lactic acid,LA)，乙酸(acetic acid,AA)和丙酸(propionic acid,PA)含量[15]。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定滤液中氨态氮(ammonia nitrogen,AN)含量[16]。

1.4 细菌多样性分析

根据Li等人[17]所述的方法提取青贮饲料样品中细菌的DNA，使用Phusion®高保真PCR预混液(New England Biolabs)进行PCR反应。选择515F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和907R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGC-3)作为引物来扩增16S rRNA基因，使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)来纯化PCR产物，然后在Novogene Company使用IlluminaMiSeq PE2500平台的成对末端(250 bp)测序。排出纯化的PCR产物中的条形码和引物，以获得高质量的序列。测序后，使用Trimmomatic处理原始序列，PE读数与FLASH(V 1.2.7)重叠，以组装最终的V3-V4标签序列。有效标签是通过Uchime(4.2.40版)方法生成，在Usearch软件平台(版本7.1)上，采用uparse方法将操作分类单元(OTU)分配给截止水平为3%的16S rRNA，根据OTU的结果，使用Mothur(版本v.1.30.1)生成α多样性(Chao 1和Shannon指数)。

1.5 数据分析

采用SPSS 19.0对青贮样品60 d后的数据进行单因素方差分析，通过Tukey的Studentized范围检验确定平均值之间的显著差异。

2 结果与分析

2.1 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料营养成分的影响

由表1可知，与CK和LP处理相比，BS处理的玉米青贮饲料中WSC含量显著增加(P<0.05)。此外，LP处理的玉米青贮饲料中NDF含量显著高于CK(P<0.05)。

表1 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料营养成分的影响

2.2 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料发酵品质的影响

由表2可知，与CK和LP处理相比，BS处理的玉米青贮饲料中pH值显著升高(P<0.05)。此外，LP处理的玉米青贮饲料中AN含量显著高于CK(P<0.05)。

表2 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料发酵品质的影响

2.3 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料微生物alpha多样性的影响

由表3可知，LP处理的玉米青贮后，其覆盖率显著低于CK，观测到的物种数显著高于CK(P<0.05)。2种添加剂处理的玉米青贮饲料中微生物多样性(包括Chao1指数、Simpson指数和Shannon指数)高于CK。

表3 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料微生物alpha多样性的影响

如图1所示，CK中主要的微生物为短乳杆菌属(Lactobacillusbrevis)细菌，其次为植物乳杆菌属(Lactobacillusplantarum)和人参乳杆菌属(Lactobacillusginsenosidimutans)细菌。玉米经2种添加剂处理青贮后，其细菌群落组成发生一定变化。与CK相比，2种添加剂处理的玉米青贮饲料中短乳杆菌属(Lactobacillusbrevis)细菌的相对丰富度降低，植物乳杆菌属(Lactobacillusplantarum)和斯比氏乳杆菌属(Lactobacillusspicheri)细菌相对丰富度增加。

图1 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料样本在属水平上的细菌丰富度

在青贮发酵过程中，饲料发酵特性的变化与微生物群落的代谢作用密切相关。从发酵特性与青贮饲料中微生物相关性之间的关系来看(图2)，玉米青贮饲料中斯比氏乳杆菌属(Lactobacillusspich-eri)细菌与氨态氮的含量呈正相关(P<0.05)，与乙酸的含量呈极正相关(P<0.01)。短乳杆菌属(Lactobacillusbrevis)细菌与氨态氮含量呈负相关(P<0.05)。

图2 影响高水分全株玉米青贮饲料细菌属水平群落组成的环境影响因子

3 讨论

3.1 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料营养成分和发酵品质的影响

苯甲酸钠是一种发酵抑制剂，它可以有效抑制霉菌和酵母菌等不良微生物的生长[18]，减少其对营养物质的消耗，使得WSC得以保存。因而，BS处理的青贮饲料中WSC含量高于对照。pH是评价青贮饲料品质的直观指标。本研究中，所有处理组的pH值均低于4.2，达到优质青贮饲料标准。而BS处理的玉米青贮饲料pH值高于对照可能是乳酸发酵受阻。Kung的研究结果表明，乳酸发酵受阻会导致青贮饲料的pH值升高[19]。本研究中，用LP处理的玉米青贮后，其AN含量高于对照，这与苗芳等人的研究结果类似[20]。出现这一现象的原因可能是植物乳杆菌的接种效果不理想，不能有效抑制青贮过程中微生物和植物蛋白酶对氨基酸和蛋白质的降解[21]。

3.2 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料微生物多样性的影响

本研究中，LP处理的玉米青贮饲料中观测的物种数量和微生物多样性高于对照，这可能与玉米的含水量高有关。王飞等人的研究表明，外源乳酸菌在高水分的青贮饲料中接种效果会减弱，不能有效地抑制不良微生物的生长和繁殖[22-23]。BS处理的玉米青贮饲料中微生物多样性高于对照可能与其pH值高于对照有关。有研究表明，青贮饲料的pH值过高会导致微生物多样性增加[24]。

3.3 添加剂对高水分全株玉米青贮饲料细菌群落组成的影响

高水分全株玉米青贮后，乳杆菌属细菌成为主要的优势菌群，这与付彤的研究结果类似[25]。Ni等人报道，乳杆菌的存在有利于青贮饲料的乳酸发酵，在青贮后期降低pH值方面起到重要作用[26]。本研究中，2种添加剂处理的玉米青贮饲料中斯比氏乳杆菌属和植物乳杆菌属细菌相对丰富度增加。斯比氏乳杆菌是一种可以产细菌素的乳酸菌，它的存在会抑制金黄葡萄球菌、梭菌和蜡状芽孢杆菌等不良微生物的生长[27]。而植物乳杆菌是一种同型发酵乳酸菌，它可以增加青贮饲料中乳酸含量，迅速降低pH值，避免青贮饲料中营养物质被一些不耐酸的有害微生物分解[20]。理论上，2种添加剂的处理可以改善全株玉米青贮饲料的品质。然而，2种添加剂的处理却导致全株玉米青贮饲料中短乳杆菌属细菌相对丰富度降低。这可能与其他乳杆菌属细菌相对丰富度的增加有关(图1)，其他乳杆菌数量的增多会与短乳杆菌竞争有限的营养物质，从而抑制短乳杆菌的生长和繁殖。短乳杆菌作为一种异型发酵乳酸菌，在发酵的过程中会产生大量具有抗菌性极强的挥发性脂肪酸，能够提高青贮饲料的有氧稳定性[28]，其数量的减少会增加青贮饲料有氧变质的机率。因此，2种添加剂的处理对全株玉米青贮饲料品质的改善作用是有限的。

3.4 高水分全株玉米青贮饲料发酵品质与细菌群落组成的相关性

青贮发酵是一个复杂的过程，微生物在青贮发酵的过程中起着至关重要的作用，斯比氏乳杆菌属于专性异源发酵菌，它可以在厌氧条件下将乳酸转化为乙酸和1,2-丙二醇等产物[29]。所以在一定条件下斯比氏乳杆菌数量的增加，会提高青贮饲料中乙酸的浓度。本研究中，短乳杆菌数量与氨态氮含量成反比，这可能与短乳杆菌的发酵类型有关。短乳杆菌是一种异型发酵乳酸菌，在发酵时会生成乙酸等抑菌物质，抑制某些代谢产物为氨态氮的微生物生长，因此，短乳杆菌数量的增加会导致这类微生物数量的减少，从而使青贮饲料中氨态氮含量下降[30]。

4 结论

2种添加剂均使高水分全株玉米青贮饲料的细菌群落组成发生一定变化，高水分全株玉米青贮饲料以乳杆菌属细菌为优势菌群(>70%)，2种添加剂均使高水分全株玉米青贮饲料中植物乳杆菌属和斯比氏乳杆菌属细菌相对丰富度增加，此外，2种添加剂均使高水分全株玉米青贮饲料的细菌多样性增加。与对照相比，苯甲酸钠处理的高水分全株玉米青贮后pH值升高，氨态氮含量增加，有机酸含量减少。植物乳杆菌处理的高水分全株玉米青贮饲料中有机酸和氨态氮含量增加，pH值降低，但效果不明显。因而，对于高水分全株玉米青贮饲料，添加苯甲酸钠和植物乳杆菌对其品质改良无显著作用。