液质联用法测定水稻中烯啶虫胺及其代谢物

杜 亭,方国林,乔 琳,朱仁发

(1.合肥学院a.生物食品与环境学院;b.能源材料与化工学院，合肥 230601；2.安徽华辰检测技术研究院有限公司，合肥 230601)

0 引 言

烯啶虫胺最早是由日本武田公司研发的新烟碱类杀虫剂，具有高效、低毒、内吸性强、无交互抗性和易降解等优良的性质，是新一代环境友好型杀虫剂。烯啶虫胺与其他新烟碱类杀虫剂相似，主要作用于害虫的神经系统，通过阻断害虫正常的中枢神经传导而使其死亡，目前多用于防治水稻、蔬菜、水果等农作物病虫害，对蚜虫、叶蝉、飞虱、粉虱和蓟马等刺吸式口器害虫有较好的防治效果。[1]

相关研究表明，烯啶虫胺在植物中代谢产生2-[N-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-乙基]氨基-2-甲基亚氨基乙酸(2-[N-(6-chloro-3-pyridylmethyl)-N-ethyl] amino-2-methyliminoacetic acid，CPMA)、 N-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-乙基-N’-甲基甲脒(N-(6-chloro-3-pyridylmethyl)-N- ethyl -N’ -methylformamidine，CPMF)等物质，化学结构式见图1。这些代谢物的毒性与母体大致相同，并且比母体表现出更强的迁移性和持久性。[2]GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[3]中对烯啶虫胺制定了相关标准：稻谷(0.5mg/kg)、糙米(0.1mg/kg)、棉籽(0.05mg/kg)、结球甘蓝(0.2mg/kg)、柑(0.5mg/kg)、橘(0.5mg/kg)、橙(0.5mg/kg)，但其监测的作物种类较少，监测定义仅为烯啶虫胺母体，而对其代谢物CPMA、CPMF无相关要求。

图1 烯啶虫胺及其代谢物CPMA、CPMF的化学结构式

QuEChERS是2003年由美国农业部最早提出的一种新的样品前处理方法，是利用吸附剂与基质中的杂质相互作用，从而吸附杂质达到除杂净化的目的，目前已经用于多领域的样品前处理，特别是在农药残留检测领域应用十分广泛。[4]相比传统的固相萃取、溶剂萃取、索氏提取等样品前处理方法，QuEChERS前处理法仅需少量高效的提取试剂和净化提取试剂，通过简单的离心操作，便可将目标组分与其他杂质分离，具有提取时间短、过程简便、环境友好等优点。

目前，国内外已有关于烯啶虫胺在甘蓝、苹果、柑橘、棉花等作物及土壤中残留及消解动态的研究报道。侯少岩等[5]建立了烯啶虫胺在金银花中的气相色谱检测方法，方法灵敏度高、线性较好，但是保留时间7.68min相对LC- MS较长，对于大批量检测农作物中烯啶虫胺含量较耗时。檀笑昕等[6]建立了测定土壤中烯啶虫胺含量的高效液相色谱方法；Malgorzata、潘金菊等[7-8]建立了测定烯啶虫胺含量的超高效液相色谱-串联质谱法；Laura等[9]建立了毛细管电泳串联质谱检测烯啶虫胺含量的方法，但相关水稻样品中烯啶虫胺及其代谢物的残留分析方法研究较少。对比以上检测方法，QuEChERS-液相色谱串联质谱法具有消耗有机试剂少、操作简便、提取时间及出峰时间短等优点，适用于快速检测大批量农残样品。近年来，烯啶虫胺在各类农作物上的使用日益广泛，为保障消费者的食品安全，急需建立农作物中烯啶虫胺及其代谢物的快速检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

乙腈、甲酸(色谱纯，美国TEDIA公司)；N- 丙基乙二胺粉末(分析纯，Agela Technologies公司)；C18粉末(分析纯，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；烯啶虫胺标准品(纯度99.1%，上海市农药研究所有限公司)； CPMA标准品(纯度98.7%，FUJIFILM wakopure chemical公司)；CPMF标准品(纯度99.1%，FUJIFILM wakopure chemical公司)。

LCMS- 8050液相色谱- 三重四极杆质谱联用系统(日本岛津公司)；XD- H旋涡混合器(上海汉诺仪器有限公司)；AUW- 220D电子天平，感量为0.000 01g(日本岛津公司)；LD5- 2B离心机(北京雷博尔离心机有限公司)；SHZ- 82水浴恒温振荡器(常州国宇仪器制造有限公司)；JK-500DB超声波清洗器(合肥市金尼克机械制造有限公司)；0.22μm有机相针式滤器、0.22μm水相针式滤器(上海安谱实验科技股份有限公司)；移液枪(100～5 000μL，德国Eppendorf公司)。

1.2 标准储备液配制

称取烯啶虫胺标准品0.010 09g(精确至0.000 01g)置于10 mL容量瓶中，用色谱纯乙腈溶解并定容至刻度，配置成1 000mg/L的烯啶虫胺标准储备液。

称取烯啶虫胺代谢物CPMA标准品0.010 13g(精确至0.000 01g)置于10 mL容量瓶中，用色谱纯乙腈溶解并定容至刻度，配置成1 000mg/L的代谢物CPMA标准储备液。

称取烯啶虫胺代谢物CPMF标准品0.010 09g(精确至0.000 01g)置于10 mL容量瓶中，用色谱纯乙腈溶解并定容至刻度，配置成1 000mg/L的代谢物CPMF标准储备液。

1.3 系列标准工作溶液制备

分别用水稻稻壳、秸秆空白样品提取液配成烯啶虫胺及烯啶虫胺代谢物CPMA、烯啶虫胺代谢物CPMF系列标准工作溶液，浓度梯度为1 mg/L、0.2 mg/L、0.05 mg/L、0.01 mg/L、0.005 mg/L、0.002 5 mg/L；用水稻糙米空白样品提取液配成烯啶虫胺代谢物CPMA及烯啶虫胺代谢物CPMF系列标准工作溶液，浓度梯度为0.25 mg/L、0.05 mg/L、0.025 mg/L、0.005 mg/L、0.002 5 mg/L；用水稻糙米空白样品提取液配成烯啶虫胺系列标准工作溶液，浓度梯度为0..5 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L、0.005 mg/L、0.002 5 mg/L。

1.4 样品前处理

水稻稻壳、秸秆(烯啶虫胺及其代谢物CPMA、CPMF)：称取2.0g粉碎混匀的水稻稻壳或秸秆样品，置于50 mL离心管中，加入乙腈：水=65:35的混合溶液20ml振荡2min，20℃超声提取45min，置于离心机以3 000r/min离心5min。移取1mL上清液于装有50mgPSA和50mg C18的2mL离心管中，涡旋1min，静置2min，取上清液过0.22μm滤膜至进样瓶中，上机检测。

水稻糙米(烯啶虫胺)：称取5.0g粉碎混匀的水稻糙米样品，置于50 mL离心管中，加入10mL水，涡旋2min，振荡提取45min，置于离心机以3 000r/min离心5min，取上清液过0.22μm滤膜至进样瓶中，上机检测。

水稻糙米(烯啶虫胺代谢物CPMA、CPMF)：称取5.0g粉碎混匀的水稻糙米样品，置于50 mL离心管中，加入乙腈：水=65:35的混合溶液20ml，振荡2min，20℃超声提取45min，置于离心机以3 000r/min离心5min，取上清液过0.22μm滤膜至进样瓶中，上机检测。

1.5 器检测条件

1.5.1 液相色谱分析条件

色谱柱：Shim-pack GIST C18柱，2.1mm(id)×100mm，粒径2μm；柱温：40℃；流动相：0.1%甲酸水溶液/ 乙腈(70/30)，等度洗脱；流速：0.2mL/min；进样量：1μL。根据保留时间(RT)定性，外标法定量。

1.5.2 质谱条件

离子源：ESI+；接口电压：4.5kV；DL管温度：250℃；加热块温度：400℃；雾化气流量：3L/min；干燥气流量：10L/min；碰撞气：氩气；监测模式：多反应监测(MRM)。多反应监测条件如表1所示。

表1 多反应监测(MRM)条件

2 结果与分析

2.1 标准曲线的线性范围、检出限

按照试验方法测定系列标准工作溶液，以标准样品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其线性范围、线性回归方程、相关系数及方法检出限见表2。结果表明，液相色谱串联质谱检测方法中，3种化合物在0.002 5～1 mg/L范围内呈现良好的线性关系，水稻稻壳中烯啶虫胺及其代谢物CPMA、CPMF的相关系数分别为0.999 9、0.998 7和0.998 2，水稻秸秆中烯啶虫胺及其代谢物CPMA、CPMF的相关系数分别为0.999 7、0.998 6和0.999 5，水稻糙米中烯啶虫胺及其代谢物CPMA、CPMF的相关系数分别为0.998 3、0.999 9和0.999 8，3种待测物的最低检出限均为0.002 5mg/L。

表2 稻壳、秸秆、糙米基质中的线性参数及检出限

2.2 水稻样品中的回收率和精密度试验

回收率是评价检测方法准确度的有效数值，通常至少设置3个不同的添加水平，每个添加水平至少5个重复。添加水平应当包含GB 2763—2019中规定的食品中农药最大残留限量和检测方法的定量限，定量限一般为0.01 mg/kg～0.05 mg/kg，再增加一个能覆盖最高残留限量的添加水平。

GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[3]中制定了烯啶虫胺在糙米中最大残留限量0.1mg/kg，并且在残留定义上只明确了烯啶虫胺母体，而对其代谢物CPMA、CPMF无相关要求。在实际检测中，对于未规定最大残留限量的农药代谢物，其最大残留限量一般根据母体的限量值确定。

2.2.1 水稻稻壳的添加回收率

分别将0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、2 mg/kg的烯啶虫胺、烯啶虫胺代谢物CPMA、烯啶虫胺代谢物CPMF添加到水稻稻壳的空白样品中，混匀，静置30min，按照试验方法平行测定5次，计算平均值，试验结果见表3。结果显示：本次试验烯啶虫胺在稻壳中的平均回收率为94.21%～102.65%，烯啶虫胺代谢物CPMA在稻壳中的平均回收率为96.58%～100.47%，烯啶虫胺代谢物CPMF在稻壳中的平均回收率为91.26%～95.88%，试验相对标准偏差≤3%，符合加标回收率要求，说明本方法准确可靠。

表3 水稻稻壳中烯啶虫胺及其代谢物CPMA、CPMF的添加回收率

2.2.2 水稻秸秆的添加回收率

分别将0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、2 mg/kg的烯啶虫胺、烯啶虫胺代谢物CPMA、烯啶虫胺代谢物CPMF添加到水稻秸秆的空白样品中，混匀，静置30min，按照试验方法平行测定5次，计算平均值，试验结果见表4。结果显示：本次试验烯啶虫胺在秸秆中的平均回收率为86.02%～94.39%，烯啶虫胺代谢物CPMA在秸秆中的平均回收率为81.82%～85.18%，烯啶虫胺代谢物CPMF在秸秆中的平均回收率为80.13%～86.04%，试验相对标准偏差≤3%，符合加标回收率要求，说明本方法准确可靠。

表4 水稻秸秆中烯啶虫胺及其代谢物CPMA、CPMF的添加回收率

2.2.3 水稻糙米的添加回收率

分别将0.02 mg/kg、0.1 mg/kg、1mg/kg的烯啶虫胺、烯啶虫胺代谢物CPMA、烯啶虫胺代谢物CPMF添加到水稻糙米的空白样品中，混匀，静置30min，按照试验方法平行测定5次，计算平均值，试验结果见表5。结果显示：本次试验烯啶虫胺在糙米中的平均回收率为95.03%～104.42%，烯啶虫胺代谢物CPMA在糙米中的平均回收率为85.06%～90.29%，烯啶虫胺代谢物CPMF在糙米中的平均回收率为89.17%～94.07%，试验相对标准偏差≤3%，符合加标回收率要求，说明本方法准确可靠。

表5 水稻糙米中烯啶虫胺及其代谢物CPMA、CPMF的添加回收率

续表5

3 结 论

本试验采用了QuEChERS前处理方法，建立了LC-MS同时测定水稻样品中烯啶虫胺及其代谢物的残留分析方法。该方法操作简单、快速、准确、灵敏度高，满足水稻稻壳、秸秆、糙米中烯啶虫胺及其代谢物的快速检测和定量分析要求，可广泛应用于粮谷中农药快速批量分析。