原发性肝癌患者血清miR-146a、miR-202、miR-148b的表达及意义

尹寿新 赵静 亓麟 周童 杨廷廷 黄加国

原发性肝癌(primary liver cancer，PHC)是一种常见的肝脏恶性肿瘤，侵袭能力极强，是死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。PHC在全球的发病率排名第6位，死亡率排名第3位[2]。>50%的PHC发病原因与乙肝病毒感染相关，每年新增的PHC患者超过50万例[3]。目前，临床上对PHC的早期诊断仍很困难，生物学标记物的灵敏性和特异度均不高，导致对肝癌的诊断价值欠佳，因此急需找到对肝癌早期诊断的标志性物质。近年来，微小RNA(miRNA)的异常表达可影响肿瘤的发生和发展过程。miRNAs是一种高度保守的非编码的单链RNA，其在机体内通过在RNA转录水平上结合特异性的靶基因，从而达到基因沉默的效果，充当“基因海绵”的作用，从而发挥调节功能[4,5]。相关报道证明，miR-146a在肺癌、乳腺癌和肝癌中表达异常增高，通过高表达来抑制其靶基因的表达，从而影响肿瘤的增殖[6]。另有报道，miR-202在胃癌中表达降低，可抑制胃癌细胞增殖并诱导其凋亡，发挥类似抑癌基因的作用[7]。而miR-148b的相关报道较少，Nie等[8]发现miR-148b的表达与肝癌患者的预后相关。国内外研究发现多种miRNAs在人类肝癌细胞中异常表达[9]。本研究通过对原发性肝癌患者中miR-146a、miR-202和miR-148b的表达研究，分析其与临床病理参数的相关性，分析它们之间表达水平的相关性，为肺癌的诊断、治疗及预后提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年2月至2019年2月首次治疗并经病理确诊为原发性肝癌的78例患者作为研究对象。其中男48例，女30例；平均年龄(46.8±6.8)岁；其中具有乙肝病史61例，临床TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期33例，Ⅲ期18例。另外选取同期体检正常者58例作为对照组，其中男35例，女23例；平均年龄(44.9±6.4)岁。2组资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，所有研究过程均符合为院医学伦理委员会的相关规定。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：(1)所有患者经由病理组织学确诊；(2)患者的临床资料均完整性高，且顺从性好；(3)经患者及其家属同意，签署知情同意书。排除标准：(1)伴有高血压、长期酗酒等患者；(2)伴有心血管、肾脏病变等患者；(3)伴有其他恶性肿瘤的患者；(4)伴有精神病患者。

1.3 实验材料与仪器 Trizol试剂由美国Invitrogen公司提供，cDNA第一链合成试剂盒和SYBR Green Master Mix试剂盒均由Vazyme公司提供，酶联免疫试剂盒由ebioscience公司提供，miR-146a、miR-202和miR-148b引物由南京金唯智生物技术有限公司合成。主要仪器为Thermo公司生产的紫外分光光度计和TCA5020的普通PCR仪，美国ABI公司的7500-实时荧光定量PCR仪，日本SANYO公司提供的凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司提供的电泳仪和电泳槽，多功能酶标仪由美国Thermo公司提供。见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 方法 抽取清晨空腹静脉血5 ml进行检测，2 000 r/min离心10 min，分离出血清，应用RT-PCR法检测miR-146a、miR-202和miR-148b的表达水平。用Trizol试剂提取血清中RNA，整个过程严格按照操作说明书进行。提取肝癌患者血清和正常人血清的RNA。miR-146a、miR-202和miR-148b茎环结构逆转录引物序列为5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACATGGTT-3’。具体的逆转录条件为16℃(30 min)、42℃(30 min)和75℃(15 min)，在进行PCR反应时，先使用95℃变性10 min，温度维持15 s，而后用60℃反应1 min，连续进行40个循环，每个反应平均进行3次。对反应管中荧光信号达到指定区域经历的循环数，即Ct值，采用U6为内参，使用相对定量法计算肿瘤组织目的基因表达水平与配对的正常组织相差的倍数，即2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(肿瘤CtmiRNA-CtU6)-(正常CtmiRNA-CtU6)。

1.5 观察指标 对比肝癌患者和正常人的血清miR-146a、miR-202和miR-148b的表达差异，同时分析其与临床病理参数的联系；对miR-210-3p和p21、p53、Ki67和HIF-1α表达水平的相关性进行分析。

2 结果

2.1 2组受试者miR-146a、miR-202和miR-148b表达水平比较 与对照组比较，观察组肝癌血清中miR-146a的表达水平明显升高(P<0.05)，miR-202和miR-148b的表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 肝癌患者血清中miR-146a、miR-202和miR-148b的表达水平与临床病理参数特征的关系 肝癌血清中miR-146a、miR-202和miR-148b的表达水平均与患者的性别、年龄、分化程度、TNM分期、转移与否、是否发生肝硬化、HBV是否有感染、血清AFP水平、包膜是否浸润、肿瘤直径和肿瘤部位均无关(P>0.05)，而与患者的肿瘤数目间差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 2组受试者miR-146a、miR-202和miR-148b表达水平比较

表3 肝癌患者血清中miR-146a、miR-202和miR-148b的表达水平与临床病理参数特征的关系

2.3 2组miR-146a、miR-202和miR-148b的表达水平比较 与非乙肝组比较，乙肝组肝癌血清中miR-146a的表达水平明显升高(P<0.05)，miR-202和miR-148b的表达水平显著降低(P<0.05)。见表4。

2.4 肝癌患者中miR-146a、miR-202和miR-148b的表达量间的相关性分析 应用Pearson相关性分析发现，肝癌患者中miR-146a的表达水平与miR-202和miR-148b的表达水平呈负相关(r=-0.825，P=0.001；r=-0.768，P=0.012)，而肿瘤患者中miR-202的表达水平与miR-148b的表达水平呈正相关(r=-0.705，P=0.010)。见图1～3。

表4 乙肝患者和非乙肝患者miR-146a、miR-202和miR-148b的表达水平比较

3 讨论

原发性肝癌的发生与发展涉及了很多生物学和化学的致癌因素，其发病隐匿，预后不良，极少数在初期进行手术治疗，其肿瘤癌变的机制并不明确。目前，临床上常用甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)用于早期原发性肝癌的诊断，其检测灵敏方便；然而，相关研究显示仍有30%的原发性肝癌患者检测呈现阴性，阳性表达也有很多[10]，因此，大幅度限制了AFP在肝癌早期检测的应用。另外临床上常用活检和影像学来检测早期的原发性肝癌，但均由于其灵敏度和特异性的局限性，导致诊断价值欠佳[11]。近年来，随着分子生物学的发展，miRNAs是近年来研究发现并成为研究热点的一类小分子编码RNA。大量研究发现，miRNAa在肿瘤中有表达谱的改变，大部分采集的组织样本，限制了临床的应用，但miRNA在血清中稳定存在，不会轻易被RNA酶降解，且水平在组织中具有特异性[12]，因此，miRNA可成为潜在的肿瘤诊断的生物学标记。

目前，大部分miRNA分子都是通过与靶基因的3’UTR区域结合而发挥细胞调节作用。miR-146a，我们通过Targetscan软件预测其靶基因为FOXO1，FOXO1是一个转录因子，是一种抑癌基因，相关研究证明，miR-146a在非小细胞癌、乳腺癌等癌症中均特异性表达，因其与靶基因FOXO1在mRNA水平特异性结合，从而抑制了抑癌基因FOXO1的表达，从而达到促进肿瘤细胞增殖的作用[13]。FOXO1在调控肝癌发生与发展的机制可能是FOXO1表达下调后，肿瘤细胞周期停滞能力障碍有关。也有相关研究表示，miR-146a可作为癌基因促进宫颈癌和结肠癌的发生与转移[14,15]。本研究中，原发性肝癌患者中的miR-146a的表达水平是显著高于正常对照组(P<0.05)，说明了miR-146a在原发性肝癌中是高表达水平状态。

在靶基因预测软件Targetscan中，miR-202的靶基因为Gil1。Gil1首次在恶性胶质瘤细胞中被发现，Gil1是肿瘤发生过程中Hh通路上的一个促癌基因，在很多肿瘤中发现高表达，且表达量与肿瘤的分化程度相关[16]，相关文献证明，在胃癌细胞和组织中，miR-202的表达水平显著低于正常组，其在体外实验也证明了miR-202是通过靶向抑制Gil1的表达功能，从而抑制了胃癌细胞的增殖及促进其凋亡[17]。同样的，miR-148b在报道中已被证实，其靶基因是葡萄糖基转移酶(GTF2H1)，相关研究证明，GTF2H的rs3802967位点的改变使得GTF2H1的蛋白表达发生变化，导致癌症患病的风险增加，GTF2H与肿瘤的增殖及转移具有相关性[18]，关于miR-148b与肿瘤的机制研究甚少。另有研究证实，miR-148b在肝转移中表达水平显著下降[19]，在本研究中，发性肝癌患者中的miR-202和miR-148b的表达水平低于正常对照组(P<0.05)。在研究miRNA与临床病理参数的关系，我们发现miR-146a、miR-202和miR-148b均与肿瘤数目具有相关性(P<0.05)，多发性肿瘤的miR-146a水平高于单发性肿瘤，miR-202和miR-148b的水平低于单发性肿瘤，说明miR-146a、miR-202和miR-148b与肝肿瘤的增殖密切相关。且我们发现，乙肝组miR-146a显著高于非乙肝患者组(P<0.05)，而miR-202和miR-148b低于非乙肝患者组(P<0.05)，说明乙肝对miR-146a、miR-202和miR-148b的表达均有影响且可作为乙肝的特异性诊断指标。

Pearson相关性分析发现miR-146a与miR-202和miR-148b的表达水平呈负相关(P<0.05)，miR-202与miR-148b的表达水平呈正相关(P<0.05)。其可能的作用机制均为miR-146a、miR-202和miR-148b通过“海绵效应”，在mRNA水平与分别与FOXO1、Gil1和GTF2H靶基因相结合，而靶基因通过多种代谢途径调节肝癌细胞的增殖与发展，从而达到miRNA影响了肿瘤细胞在患者体内的变化的作用。但其具体机制仍需进一步探索。

综上所述，miR-146a、miR-202和miR-148b在原发性肝癌的发生与发展中发挥着至关重要的作用，不仅仅对于肝癌或乙肝早期的诊断和治疗具有重要的临床意义，对于肝癌或乙肝患者的预后提供了理论支持。