血清miR-144、miR-518b和ACR在早期诊断妊娠期高血压肾功能损害中的应用价值

陈凌霞

妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是产科的常见病和多发病，其发病率高达5%～8%，临床上的表现以高血压，蛋白尿，水肿和肾功能发生损害为主要特点；HDCP还会增加妊娠期间不良结局的发生风险，严重威胁着母婴的安全，是孕产妇和围产儿发生死亡的主要原因[1,2]。HDCP合并肾损伤常常无明显的临床表现，血肌酐和尿素氮大多数正常。目前，24 h尿蛋白定量与尿肌酐的比值(ACR)来诊断肾损伤，然而其灵敏度和特异性仍不高，因此，寻找早期诊断HDCP肾损伤的标记物尤为重要。微小RNA(miRNA)通过调控转录水平的基因翻译，参与了胚胎的发育，细胞的增殖和分化，在妊娠高血压的形成过程中具有重要的临床意义[3]。本组研究发现联合检测miR-144，miR-518b和ACR在HDCP肾损伤的诊断具有重要的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017至2018年在我院就诊的HDCP患者118例为HDCP组，年龄24～39岁，平均年龄(31.91±2.61)岁；孕周24～35周，平均孕周(30.94±0.86)周；孕次1～4次，平均(1.84±0.46)次。根据病情不同分为妊娠高血压组(n=44)，子痫前期轻度组(n=36)和子痫前期重度组(n=38)；根据肾小球滤过率(eGFR)分为肾功能正常组(≥80 ml/min，n=72)和肾功能异常组(<80 ml/min，n=46)。根据KDIGO制定急性肾损伤的标准将肾功能异常组分为1期17例，2期15例和3期14例。选择同期在我院体检的正常孕妇45例为正常妊娠组，年龄24～39岁，平均年龄(32.37±3.17)岁；孕周24～35周，平均孕周(29.46±0.93)周；孕次1～4次，平均(1.79±0.35)次。选择同期在我院行健康体检女性30例为健康对照组，其中年龄24～39岁，平均年龄(32.37±2.46)岁。HDCP组、正常妊娠组、健康对照组年龄等基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：均签署知情同意书，经医院伦理委员会审核通过；妊娠女性均为单胎。

1.2.2 排除标准：急性和慢性感染性疾病；血液性和免疫性疾病；恶性肿瘤；心肝肾等重要脏器功能障碍；智力障碍和精神疾病。

1.3 方法

1.3.1 血液标本和尿液标本采集和检测:患者入院后清晨空腹肘静脉血约10 ml，在4℃的条件下放置30 min，低速离心20 min，离心速度1 800 r/min，离心半径为15 cm，离心后去上清液，将其保存在-70℃冰箱中保存。另外收集患者早晨中段尿液5 ml，采用3 000 r/min的离心速度，离心10 min，选取上清液，放置在-70℃冰箱待测。采用免疫比浊法测点尿微量蛋白(mALB)，采用没法检测肌酐。

1.3.2 miRNA提取和逆转录反应:根据miRNeasy提取试剂盒的说明书提取miRNA，并通过紫外分光度将吸光度的比值在1.8～2.0的标本保存用于后续检测，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反转录试剂盒的使用说明书将miRNA反转录为cDNA，标本保存在-70℃的冰箱中。

1.3.3 qRT-PCR检测:根据GenBank中的miR-144，miR-518b和U6的序列号，用Premier Primer5.0软件进行引物设计，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-144引物序列，上游：5’-GGGAGATCAGAAGGTGATF-3’，下游：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，miR-518b的引物序列，上游：5’-GCAAAGCGCTCCCCTTTAG-3’，下游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和U6引物序列，上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。qRT-PCR总反应体系为25 μl，包括上下游引物各1.0 μl(浓度10 μmmol/L)，cDNA为0.8 μl，RNaseH2O为 12.2 μl和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 ml。反应条件为：预变性温度95℃ 10 min，95℃和60℃分为5 s和60 s，总共进行40个循环。在60℃下用ABI7700软件收集荧光信号进行溶解曲线分析，每个样品进行3个平行复孔，相对表达量采用表示2-ΔΔCt，公式表达为ΔΔCt=实验组(Ct目标基因-CtU6)-对照组(Ct目标基因-CtU6)。

1.4 观察指标 比较不同类别、不同程度3组血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平，与HDCP严重程度，HDCP肾损害和肾损害严重程度的关系，及其在HDCP肾损伤中的诊断效能。

2 结果

2.1 3组血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平比较 HDCP组的miR-144表达明显低于正常妊娠组和健康对照组(P<0.01)，而正常妊娠组明显低于健康对照组(P<0.01)；HDCP组的miR-518b、ACR和mAlb水平明显高于正常妊娠组和健康对照组(P<0.01)，而正常妊娠组明显高于健康对照组(P<0.01)。见表1。

表1 3组血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平比较

2.2 血清miR-144，miR-518b，ACR和mAlb水平与HDCP严重程度的关系 血清miR-144表达水平子痫前期重度组明显低于子痫前期轻度组和妊娠高血压组(P<0.01)，并且子痫前期轻度组明显低于妊娠高血压组(P<0.01)；而血清miR-518b表示，ACR和mAlb水平子痫前期重度组明显高于子痫前期轻度组和妊娠高血压组(P<0.01)，并且子痫前期轻度组明显高于妊娠高血压组(P<0.01)。见表2。

表2 血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平与HDCP严重程度的关系

2.3 血清miR-144，miR-518b，ACR和mAlb水平与HDCP肾功能损害的关系 肾功能异常组的血清miR-144表达明显低于肾功能正常组(P<0.01)，而肾功能异常组血清miR-518b，ACR和mAlb水平明显高于肾功能正常组(P<0.01)。见表3。

表3 血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平与HDCP肾功能损害的关系

2.4 血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平与HDCP肾功能损害严重程度的关系 血清miR-144表达随着HDCP肾功能损害分期升高而降低(P<0.01)，而miR-518b，ACR和mAlb水平随着肾功能损害分期的升高而升高(P<0.01)。见表4。

表4 血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平与HDCP肾功能损害严重程度的关系

2.5 血清miR-144，miR-518b和ACR在诊断HDCP肾功能损害的效能 miR-144(Z=3.212，P<0.01)，miR-518b(Z=2.332，P<0.05)和ACR(Z=2.722，P<0.01)在诊断HDCP肾功能损害具有较高的效能明显优于mALB，而miR-144，miR-518b和ACR指标之间差异无统计学意义(P>0.05)。将miR-144， miR-518b和ACR指标进行二元logistics分析的方差-2.687×XmiR-144+35.277×XmiR-518b+0.077×XACR-32.109得出联合检测指标，联合检测的灵敏度为100%，特异性为86.1%，曲线下面积为0.980明显优于单个指标miR-144(Z=3.425，P<0.01)，miR-518b(Z=3.817，P<0.01)和ACR(Z=3.592，P<0.01)。见表5，图1。

表5 miR-144，miR-518b和ACR在诊断妊娠期高血压疾病肾功能损害的效能

图1 miR-144、miR-518b和ACR在诊断妊娠期高血压疾病肾功能损害的效能

3 讨论

HDCP与原发性高血压的发病机制并不相同，孕妇的免疫功能异常是疾病发生的重要原因，是导致孕产妇和围产儿死亡的重要原因之一。肾脏是HDCP攻击的主要靶器官，其主要机制是通过诱导肾小球压力升高，损害内皮细胞的功能，诱发一系列细胞因子释放，最终导致肾脏功能受损[3]，直接影响血管活性物质的调节和体液平衡，引起机体代谢障碍，增加高血压的病情，加重肾功能损伤，甚至出现尿毒症[6,7]。因此，早期对肾功能损伤进行早期诊断，并有效干预，是最大程度降低围产期母婴死亡率的关键。传统的诊断肾功能损害指标如肌酐和尿素氮在肾功能损害的早期，并不能出现明显改变，因为肾脏具有较大的储备功能，只有当肾小球滤过率降低>50%才能出现明显的改变。尿微量白蛋白是肾脏早期损害指标，由于其带负电荷，不能通过肾小球的滤过膜，因此在正常情况下尿液中甚微。肌酐是长期以来用于评价肾功能的指标，但在诊断HDCP肾功能损害方面存在灵敏度和特异性并不高，而ACR更能准确反映HDCP早期肾功能损伤，其具有简单方便，患者依从性好，并在HDCP肾功能损害的早期诊断中逐渐代替24 h蛋白尿[8,9]。本组研究显示HDCP患者ACR水平明显高于正常妊娠和健康对照组，与文献报道的结果[10,11]一致，并且发现随着HDCP严重程度的升高而升高，发现肾脏功能异常患者ACR水平明显高于肾功能正常患者，并随着肾功能分期的升高而升高，与文献报道的结果[12]类似，说明ACR水平与HDCP肾功能损伤具有一定的联系。在诊断HDCP肾功能损害方面，ACR>135.13时，其灵敏度为89.1，特异性为68.1，AUC为0.860明显高于单个指标mALB的诊断，但其在诊断HDCP肾损伤也有一定的局限性，其稳定性受到年龄，饮食，炎症和体内蛋白代谢的影响，因此，ACR在诊断HDCP肾损伤受到生理性蛋白尿的干扰。

miRNAs是一类有22个核苷酸左右组成的非编码RNA，其在转录和翻译水平进行基因调控，参与了疾病的发生发展。可以通过与靶基因的mRNA的非编码取结合，降解或者抑制靶基因的蛋白的翻译，从而达到基因表达的调控，在早期滋养叶细胞肾脏和发育中起到重要作用[13]。miR-144现有的研究主要集中在肿瘤的诊断和预后的研究，miR-144在胃癌，肠癌和子宫颈癌等呈低表达，并且与预后密切相关[14-16]。在良性疾病的研究中主要集中在糖尿病和高血压，发现miR-144的表达与吸烟具有明显相关性[17,18]，是发生糖尿病的危险因素。在妊娠方面报道较少，本组研究发现HDCP患者血清miR-144表达水平明显低于正常妊娠组和健康对照组，并且随着HDCP严重程度的升高而降低，说明miR-144参与了HDCP疾病的发生发展，并且是其保护因子，HDCP越严重，其表达越低。本组研究发现肾功能异常患者血清miR-144表达水平明显低于肾功能正常组，并且发现随着肾功能分期升高而出现血清miR-144表达明显降低，说明miR-144是HDCP的保护因子。在诊断HDCP肾功能损害方面，当血清miR-144表达≤2.164时，其灵敏度82.6%，特异性80.6%，AUC为0.882，明显高于mALB，说明在诊断HDCP肾功能损害方面具有较高的诊断效能。miR-518b是定位于人类19号染色体，主要在生殖系统和胎盘组织中表达，其表达在物种之间具有高度保守性，对组织具有特异性，在胎盘组织具有较高的表达[19]。在一组基因芯片技术分析发现miR-518b具有胎盘组织特异性，主要由胎盘绒毛膜滋养细胞分泌，并进入血液循环，并与胎盘的状态具有明显的相关性[20]。本组研究发现HDCP组血清miR-518b表达水平明显高于正常妊娠组和健康对照组，并且与HDCP疾病的严重程度呈正相关，说明miR-518b参与了妊娠高血压疾病的发生发展过程。本组研究还发现HDCP肾功能异常患者血清miR-518b表达水平明显高于肾功能正常组，并且随着肾功能分期升高而升高，在诊断肾功能异常方面具有较高的特异性和灵敏度，当机体血清miR-518b>0.759时，其灵敏度为78.3%，特异性84.7%，AUC为0.845明显高于mALB，说明血清miR-518b表达在诊断HDCP肾功能异常具有较高的诊断效能。本组研究发现miR-144， miR-518b 和 ACR在诊断HDCP肾功能异常的诊断效能明显优于mALB，而miR-144， miR-518b 和 ACR之间的诊断效能无明显差异，联合miR-144， miR-518b 和 ACR 3个指标形成联合检测，其灵敏度为100%，特异性为86.1%，AUC明显高于miR-144， miR-518b 和 ACR，说明三者联合检测能够明显提高诊断HDCP肾功能损害的诊断效能，，miR-144， miR-518b 和 ACR三者之间是否存在某种联系或者某种平衡，其确切机制需要进一步研究。

总之miR-144和miR-518b参与了HDCP肾损害的发生发展，血清miR-144，miR-518b和ACR检测在早期诊断HDCP肾功能损害具有较高的效能，联合检测优于单个指标。