关于组织缺氧检测方法的研究进展

赵晓露，魏福兰

氧气的供应和扩散对细胞和组织的生存是必要的。氧分压是器官生理状态的关键组成部分。在哺乳动物中，氧气是通过血液循环中的红细胞所携带的血红蛋白运输的。氧气输送取决于每个器官的代谢要求和功能状态，在诸如癌症、糖尿病、冠心病、中风等病理状态下，组织的氧合作用受到严重干扰，这与氧分压的降低有关，即“缺氧”[1]。缺氧定义为氧气的供应或输送不足以满足组织需求的状态[2]。细胞供氧不足会引起细胞应激，因此在这种压力下，细胞通常会激活细胞凋亡(程序性细胞死亡)。组织缺氧是许多疾病的标志，实体瘤[3]、心脏缺血[4]及糖尿病性视网膜病变[5]，都以缺氧为表征。同时组织缺氧在发育中起着关键作用，在器官发生过程中，胚胎处于部分缺氧的状态[6]。在正畸牙齿移动过程中，牙周组织也处于缺氧的环境中[7]。因此，对低氧环境进行可视化检测对于更好地理解其在生理学和病理学中的作用至关重要。在这篇综述中，我们将介绍一系列用于评估组织氧含量的方法。

1 极谱氧电极

该反应中的氧分子非常重要，溶解的氧在阴极被还原随之产生电流，因此电流取决于氧分子的存在。在组织低氧区域的电流远低于高氧区域的电流，所以具有高灵敏度的微电极可用于测量组织中的氧含量，在各种实验和对肿瘤的缺氧检测中此方法是有效的。曾被广泛用于评估头颈部肿瘤[10]、宫颈癌[11]和前列腺癌[12]中的氧含量。但此方法适用于比较浅表的肿瘤，仅能反应组织及肿瘤局部缺氧的情况，且创伤性比较大，在穿刺过程中存在一定的肿瘤转移风险。因存在这些不足之处，目前该检测方法在临床上运用较少。

2 近红外线光谱成像

近红外光谱成像(near-infrared spectroscopy,NIRS)是一种适用于全身各处肌肉组织和脑组织血氧含量检测的方法,也是目前进行组织血氧含量监测广泛应用的方法。它是一种非侵入性、动态监测局部组织氧含量的方法，在临床上主要应用于局部脑组织氧含量的监测上,尤其在早产儿的临床常规护理中得到广泛应用[13]。

NIRS是一种非侵入性的光学技术，依赖于生物组织对近红外光具有一定的透明度，运用光的透射和吸收原理，因氧合血红蛋白和血红蛋白具有不同的光吸收光谱[14]，可以通过测量血红蛋白饱和度研究组织氧合的动态变化[15]。近红外光谱中700～1 000 nm波长区段的近红外光对人体组织具有良好的穿透性，在此波段内NIRS信号是通过脉管系统(微动脉、毛细血管和微静脉)中的血红蛋白吸收光而获得的。它的主要优点是能够进行实时及重复性测量、无侵入性，同时它的便携式测量仪可监测人体在各种运动条件下的氧含量，使病患有较好的就医体验[16]。

3 血氧水平依赖磁共振成像

血氧水平依赖磁共振成像(blood oxygenation level dependent magnetic resonance imaging, BOLD-MRI)是一种可非侵入性、较为动态直观地反映组织氧含量的方法，有助于评价脑组织及肿瘤组织内部血管的缺氧状况，对氧气的供应情况，血管的舒张收缩及血液流量、流速、血细胞内氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的比例改变具有一定的敏感性[17]。

BOLD-MRI可检测红细胞周围的磁场变化，该变化由血红蛋白的氧状态决定[18]。它使用血红蛋白作为内源性造影剂，氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白具有不同的磁性，完全氧化的血红蛋白是反磁性的，而脱氧的血红蛋白是顺磁性的。顺磁性的脱氧血红蛋白作为对比剂，其信号强度与脱氧血红蛋白含量密切相关，所以氧饱和度的变化会引起局部磁场敏感性的变化，这些会影响弛豫时间，并且可以通过MRI进行检测。BOLD-MRI的优点是作为一种非侵入性技术，可根据需要重复进行，会极大地减少患者在临床操作中的痛苦，而且相比其他放射性检测方法比较便宜[19]。

根据BOLD-MRI的成像原理，BOLD-MRI并非直接检测肿瘤组织中的氧分压，组织的血容量及全身血红蛋白水平等因素均可影响测量结果。此外，由于仅测量了脱氧血红蛋白的浓度，在某些区域总血红蛋白浓度较高的情况下，可能结果会出现偏差[20]。

4 18氟-硝基咪唑正电子发射计算机断层显像

近些年，对肿瘤低氧微环境内成像示踪剂的研究较多，最早应用也最常见的示踪剂是18氟-硝基咪唑(18F-fluoromisonidazole,18F-FMISO，一种硝基咪唑类衍生物)[21]。其简要原理为：肿瘤组织内的细胞处于缺氧环境中，进入细胞内的示踪剂18F-FMISO中的硝基基团被硝基还原酶还原，与细胞内大分子物质形成共价键，发生不可逆性结合滞留在组织内部，18F-FMISO在缺氧组织中的滞留量与组织细胞的缺氧程度呈正相关[22]。示踪剂18F-FMISO通过正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography combined computer tomography, PET/CT),可显示肿瘤组织的缺氧状态。临床研究显示头颈部肿瘤[23]、非小细胞肺癌(non-small-cell carcinoma，NSCLC)[24]、宫颈癌[25]等肿瘤组织对18F-FMISO的摄取量与其缺氧程度之间有较为密切的联系。

应用该方法能够准确、非侵入性及动态检测组织缺氧状况，能对极谱氧电极法检测不到的深部组织进行氧含量评估[26]。但硝基咪唑的代谢依赖于有活性的电子传输酶[27]，因此在坏死组织中无法检测氧含量。同时因该方法有一定的放射毒性，检测的价格较昂贵，在一定程度上限制了其应用[28-29]。

5 缺氧相关标志物的检测

由于缺氧微环境的变化，细胞代谢会发生改变，进而一些特异性标记物的含量也会发生相应的改变。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是一种在缺氧条件下稳定存在于细胞核中的转录因子亚基，当其与缺氧诱导因子-1β(hypoxia inducible factor-1β,HIF-1β)亚基形成异源二聚体缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)后，HIF-1可与靶基因的缺氧反应元件(hypoxia response elements，HRE)序列结合，其下游多种靶基因的表达受到影响[30]，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)[31]、葡萄糖转运蛋白(glucose transporter-1,GLUT1)、碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9,CAIX)[32]、促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)[33]等，因此，HIF-1α在缺氧微环境中起着关键作用。

可以通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印迹(western blotting)以及免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)等方法对HIF-1α、VEGF、GLUT1、CAIX、EPO等基因及蛋白的表达水平进行检测，并通过相关性分析来判定组织的缺氧程度[34]。这些检测方法所用的样本通常是有活性的细胞或组织，但有时会因样本量不够而导致结果有所偏差，因此需要进行多次独立实验。

6 缺氧敏感性荧光探针

荧光探针由识别基团、连接基和荧光基团三部分构成，识别基团可响应环境变化，与细胞内物质相互作用或发生特定的化学反应，激活荧光基团发出强烈的荧光，是示踪显像工具的重要组成部分[35]。

通常情况下，组织的缺氧程度与组织内部的还原物质，如硝基还原酶(nitroreductase,NT)和偶氮还原酶(azoreductase,AzoR)等的局部浓度密切相关。因此，基于在低氧条件下还原酶可与硝基芳香族化合物或偶氮衍生物发生还原反应，通过使用具有缺氧敏感性的硝基芳族化合物或偶氮衍生物作为识别基团，与已知的荧光基团连接已经研发了许多缺氧敏感性荧光探针。

体内硝基还原酶响应的荧光探针，是将硝基芳香族化合物基团与可以在不同波长下激发荧光的荧光基团通过化学键相连[36]，在体内缺氧的情况下硝基还原酶将硝基基团还原，继而引起荧光基团释放荧光。硝基芳香族类化合物进入缺氧细胞内，在硝基还原酶的作用下发生还原反应，与细胞内大分子物质结合，滞留在细胞内，可以通过共聚焦荧光显微镜观察细胞内荧光强度，或者运用红外光谱激发成像[37]。有研究设计了2-硝基咪唑-1,8-萘二甲酰亚胺共轭物作为荧光探针，用于检测HeLa细胞的还原性应激[38]。

体内偶氮还原酶响应的荧光探针，是由偶氮基团与荧光基团相连，偶氮还原酶是体内必不可少的还原酶，可以催化偶氮键(N═N)的裂解。由于偶氮基团对氨基的保护，探针本身是不发荧光的，当在缺氧的环境中，偶氮基团被还原，偶氮键断裂，产生成能够提供电子的氨基，从而导致分子内电荷转移，使荧光基团产生强荧光信号被检测到[39]。

缺氧敏感性荧光探针具有操作简便、灵敏度高、可活体成像、实时观察等优点，在检测肿瘤细胞的缺氧状态、监测肿瘤发展进程中有广泛应用[40]。

7 进展与展望

低氧检测对人体生理及病理进程有重要临床意义，检测结果有助于医生更好地了解病程，把握病情。随着组织缺氧的检测方法被不断探索和改进，新的研究进展使连续测量、非侵入性组织氧评估和细胞内氧评估成为可能。本文介绍的这些检测方法都有各自的优缺点，因此，需要全面了解并选择合理的方法来评估组织缺氧状况，针对不同患者确定最适合的方法，来达到快速高效检测的目的。同时，针对组织细胞的缺氧环境可加以利用，设计具有缺氧靶向性的药物，针对局部组织用药，靶向精准治疗肿瘤等疾病，尽快研发应用于临床，以期早日减轻病人痛苦。