法尼醇对白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜体外抑制作用的研究

徐 瑞，顾静怡，刘思琪，段 薇，黄 云，吕 盈，徐 峥，张琴琴，魏 昕

牙髓病和根尖周病一般来源于根管内微生物的感染，根管内微生物以生物膜形式存在[1]。无论是根管预备还是根管充填，其目的都是为了消除根管内微生物的感染。粪肠球菌是一种革兰阳性兼性厌氧菌，作为牙髓感染的常见细菌，可在感染的牙髓中，持续性根尖周炎、再次感染的根管中检测出来[2-5]。粪肠球菌即使在营养物质缺乏的情况下，仍然可以形成生物膜[6]。白念珠菌与口腔内微生物存在交互作用，白念珠菌也可以在感染根管中检测出来[7]，研究表明，在外伤或术后的感染创口中可以检测到粪肠球菌和白念珠菌[8-9]，白念珠菌和粪肠球菌可混合存在于根管内，两种微生物混合形成的生物膜定植于根管内，彻底清除十分困难。微生物生物膜的存在将导致感染的持续，降低根管机械和化学预备的效果，导致根管治疗失败，根尖周组织损伤难以愈合[10]。体外白念珠菌和粪肠球菌的混合生物膜较单物种生物膜可以更好地模拟根管内或伤口的感染，而且关于粪肠球菌和白念珠菌双菌种的混合生物膜的研究较少。

临床上，采用机械预备配合化学消毒可以有效清除微生物，其中次氯酸钠以其高效的杀菌、溶解有机组织等性能，作为根管冲洗的药物已经得到广泛的研究[11-12]，但是次氯酸钠也有较高的毒性，其细胞毒性随着时间及浓度的增加而增强[13]，对根尖周组织存在一定的刺激[14]。抗菌药物对粪肠球菌和白念珠菌等微生物感染伤口的抗菌作用的研究已有相关报道[15-16]，这些药物具有一定的抗菌作用，但其效率仍有一定的局限性。法尼醇作为一种抗微生物的化学分子，对白念珠菌生物膜形成存在抑制作用[17]。法尼醇对变形链球菌和粪肠球菌也有一定的杀菌作用[18-21]。不同浓度的法尼醇对于白念珠菌和粪肠球菌双物种混合生物膜的抑制作用的效果国内外尚罕见报道。本研究探讨法尼醇对白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

白念珠菌标准株(SC5314)由上海第二军医大学药学院遗传工程国家重点实验室馈赠。粪肠球菌(ATCC29212)由江苏省口腔疾病研究重点实验室提供。法尼醇(Sigma，美国)；3，3′-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)和甲萘醌(Sigma，美国)；沙堡琼脂培养基(Sabourd’s dextroseagar, SDA)(63.0 g/L) ，脑心浸脑液肉汤培养基(BHI，OXOID，英国)；YPD培养液(2%葡萄糖，2%胰蛋白胨，1%酵母提取物)、磷酸盐缓冲液(PBS)、RPMI 1640培养基(GIBCO，美国)。96孔培养皿(Corning，美国)；麦氏比浊仪(WGZ-2XJ，中国上海昕瑞仪器仪表有限公司)；YCP系列二氧化碳培养箱(上海易亮医疗器械有限公司)；0.22 μm针孔式滤膜过滤器(Millipore，美国)；倒置显微镜(Olympus，日本)；低温高速离心机(Eppendorf，德国)；M2多功能酶标仪(Molecular Devices，美国)；LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Counting 试剂盒(Life technologies，美国)；激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss，德国)。

1.2 实验方法

1.2.1 白念珠菌菌悬液的配制 将-80 ℃保存的白念珠菌标准株(SC5314)接种到SDA培养基上生长，37 ℃，5%CO2培养24 h。取单克隆菌株于YPD培养基中，30 ℃，200 r/min摇床过夜，达到对数生长期，2 100×g离心10 min，收集YPD培养液中对数生长状态的真菌，无菌PBS洗涤2次，细胞重新悬浮于RPMI 1640培养液中，血细胞计数法制备成密度为1×106个/mL的标准菌悬液。

1.2.2 粪肠球菌菌悬液的配制 将-80 ℃保存的粪肠球菌(ATCC29212)接种到BHI培养基上生长，37 ℃培养24 h。取单克隆菌株于BHI液体培养基中，37 ℃，180 r/min摇床生长3～5 h，达对数生长期，16 000×g离心5 min，收集BHI液体培养基中对数生长状态的细菌，无菌PBS洗涤2次，细菌重悬于RPMI 1640培养液中，麦氏比浊仪计数，制备成密度为1×106个/mL的标准菌悬液。

1.2.3 白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜的制备 分别将100 μL的1×106个/mL的白念珠菌和粪肠球菌标准菌悬液以1∶1的比例接种于96孔微量培养板中[22]，37 ℃，5%CO2孵育2 h后，每孔200 μL PBS轻洗。RPMI 1640培养基继续分别培养24 h和48 h，移出培养液，轻轻冲洗培养板，倒置显微镜下初步鉴定白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜的形成。

1.2.4 法尼醇抑制白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜活性的测定 按上述方法制备24 h和48 h生物膜后，分别用含不同浓度法尼醇(100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800 μmol/L)的RPMI 1640培养基继续培养24 h[23]。设立不含法尼醇阴性对照组及不含白念珠菌和粪肠球菌的空白对照组。采用PBS溶液将XTT配成0.5 mg/mL的溶液，0.22 μm滤膜过滤，分装后-70 ℃避光保存[24]。甲萘醌用丙酮配成10 mmol/L的溶液分装，-70 ℃避光保存。临用前配制XTT/甲奈醌溶液，使甲萘醌终浓度为1 μmol/L，分别向各孔加入XTT/甲萘醌溶液100 μL，37 ℃避光反应2 h。反应结束后，酶标仪读取各孔490 nm波长处的OD值。根据公式Y=[1-(OD实验组-OD空白对照组)÷(OD阴性对照组-OD空白对照组)]×100%，计算每孔相对抑菌率(Y)，Y值越大，抑菌强度越大。抑制白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜50%活性的最低药物浓度(sessile minimal inhibitory concentration 50%，SMIC50)为Y≥50%时的最低法尼醇浓度。实验重复4次，每个浓度均设3个复孔，取平均值。

1.2.5 激光共聚焦显微镜观察法尼醇对白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜的抑菌效果 取细胞爬片放入24孔板，按上述方法制备微生物悬液，以1∶1的比例，在24孔板中各加入500 μL白色念珠菌和500 μL粪肠球菌悬液，培养2 h后移出培养液，用PBS轻轻洗去未粘附的微生物，加入1 mL 1640培养液，培养至24 h和48 h，形成生物膜。培养至所需时相后，24 h生物膜用150、400 μmol/L的法尼醇处理，48 h生物膜用200、500 μmol/L的法尼醇处理24 h。设立不含法尼醇的对照组。每个时相每个浓度各制备3个标本，移出药物及培养液，PBS洗涤后，保持生物膜表面无多余PBS，在生物膜表面滴加150 μL荧光染色液(按VSYTO-9∶VPI∶V蒸馏水=3∶3∶2000避光配制，现配现用)，室温下暗室孵育15 min，PBS洗涤，去除多余PBS，进行CLSM观察。观察条件：SYTO-9的激光发射波长为488/525 nm，PI的激光发射波长为561/642 nm，放大200倍。

1.3 统计学方法

使用SPSS25. 0统计学软件进行分析，各时相生物膜各浓度对应的指标均采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差数法(LSD法)，各浓度对应的抑菌率采用重复测量方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 倒置显微镜下观察微生物的生物膜形成

在倒置显微镜下，图1可见酵母细胞与其出芽延伸所形成的菌丝密集交织，并沿着菌丝形成团块状聚集，粪肠球菌在菌丝中间聚集，白念珠菌菌丝与粪肠球菌的混合生物膜呈多层膜状结构，48 h混合生物膜较24 h时相的更为致密。

A：24 h；B：48 h

2.2 法尼醇对白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜结构的激光共聚焦显微镜观察结果

肉眼可见细胞爬片上的浅灰白色生物膜，激光共聚焦显微镜下，红色的荧光为死的微生物，绿色的荧光为活的微生物，橘黄色的部分为活死微生物叠加显示出的荧光颜色。白念珠菌菌丝呈细长的丝状；粪肠球菌菌体直径较小，生物膜状态下活菌为一片的绿色荧光，死菌则为一片的红色荧光。粪肠球菌和白念珠菌的混合生物膜不均质，导致在激光共聚焦显微镜观察时，显微镜下部分区域荧光强度较弱较暗，部分观察区荧光强度较强较明亮。图2可见150 μmol/L法尼醇处理24 h混合微生物膜，激光共聚焦显微镜下活死微生物的比例约为50.1%，400 μmol/L法尼醇处理24 h混合微生物膜，激光共聚焦显微镜下活死微生物的比例约为81.4%。图3可见200 μmol/L法尼醇处理48 h混合微生物膜，激光共聚焦显微镜下活死微生物的比例约为50.7%，500 μmol/L法尼醇处理48 h混合微生物膜，激光共聚焦显微镜下活死微生物的比例约为81.6%。与XTT减低法检测法尼醇对24、48 h时相混合微生物膜的抑制作用相吻合。

2.3 SMIC50检测结果

法尼醇对24 h混合生物膜态白念珠菌和粪肠球菌的SMIC50值为150 μmol/L，对48 h混合生物膜态白念珠菌和粪肠球菌的SMIC50值为200 μmol/L。

2.4 不同浓度法尼醇的抑制效果

实验组法尼醇对白念珠菌和粪肠球菌的混合生物膜有抑制作用，与阴性对照组(不含法尼醇)比较有统计学差异(P<0.05)。图4显示法尼醇对白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜抑制强度与法尼醇浓度相关。随着法尼醇浓度的升高，对混合生物膜的抑制作用呈上升趋势，法尼醇浓度在100～300 μmol/L时，抑菌作用明显，且具有统计学意义(P<0.05)。100 μmol/L的法尼醇处理混合生物膜时，对48 h的混合生物膜的抑制作用高于24 h时相的生物膜，具体原因有待进一步探究。24 h和48 h时相存在主效应，各浓度存在主效应，时相浓度存在交互作用。100～300 μmol/L、800 μmol/L法尼醇对24、48 h时相生物膜的抑菌作用存在统计学差异(P<0.05)，350～700 μmol/L的法尼醇对24、48 h时相生物膜的抑菌作用无明显统计学差异(P>0.05)。

A1：法尼醇未处理的混合生物膜；A2：法尼醇抑制混合生物膜50%活性；A3：法尼醇抑制混合生物膜80%活性；绿色荧光代表活菌，红色荧光代表死菌，橙色荧光为活死菌重叠

B1：法尼醇未处理的混合生物膜；B2：法尼醇抑制混合生物膜50%活性；B3：法尼醇抑制混合生物膜80%活性；绿色荧光代表活菌，红色荧光代表死菌，橙色荧光为活死菌重叠

图4 不同浓度法尼醇对24、48 h白念珠菌和粪肠球菌混合生物被膜的影响Fig.4 Inhibitory effect of different concentrations of farnesol on mixed biofilms of Candida albicans and Enterococcus faecalis after 24 h and 48 h

3 讨 论

许多微生物以生物膜形式存在，生物膜是一种复杂的结构。以生物膜形式存在的微生物对于抗菌药物、宿主的免疫防御机制及外界压力有着更高的抵抗力[25]。白念珠菌与厌氧菌形成混合生物膜时，白念珠菌形成的生物膜提供了低氧的微环境，即使在有氧的条件下培养，白念珠菌提供的低氧微环境也可以支持厌氧菌的生长[26]。这有利于兼性厌氧菌——粪肠球菌的生长。Cruz等[27]的研究表明，粪肠球菌对白念珠菌的主要影响在于抑制白念珠菌菌丝的形成。粪肠球菌对于白念珠菌菌丝的抑制，说明白念珠菌与粪肠球菌在生物膜内可能存在拮抗作用。

本研究采用XTT减低法检测法尼醇对粪肠球菌和白念珠菌混合生物膜的抑制作用。XTT是四唑氮衍生物，甲萘醌存在时，在活细胞内线粒体脱氢酶的作用下，XTT可被还原成可溶性的棕色产物，使得不同测试孔内的溶液颜色产生差异，进一步通过酶标仪测定溶液的OD值以精确反映细胞的代谢活性。该法是目前定量研究生物膜的常用的方法，具有敏感性好、准确性好，数据稳定等优势，相较于MTT法和菌落CFU计数法，该法更简单且精确，再现性好[28-29]。同时，本研究增加了激光共聚焦显微镜观察法尼醇对白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜的抑制作用。激光共聚焦显微镜可以在不破坏细胞或组织的状态下，观察其内部结构，并对其进行实时的检测，近年来逐渐用于检测生物膜内部结构或存活能力[30-31]。通过荧光染色，区分生物膜内活死菌，更为直接地展现了生物膜内细菌的生存状态，辅助证实了法尼醇对混合生物膜的抑制作用。

抗生素的滥用导致微生物对抗生素的耐药性增加，非抗生素类药物的研究或许将更有利于微生物感染的控制。法尼醇(C15H2O6)是首次在真菌中发现的密度感应分子，外源性的法尼醇作为一种抗微生物的化学分子，可以抑制多种微生物的生长[17-21]。法尼醇微溶于水，可以积聚在微生物的生物膜上，损害生物膜的完整性导致细菌内容物的释放[32-33]。有研究证明1%法尼醇对成纤维细胞的毒性小于1%次氯酸钠[14]，表明法尼醇应用于根管冲洗或控制创口感染有一定的优势。

本研究表明法尼醇对粪肠球菌和白念珠菌的混合生物膜有一定的抑制作用，可以抑制生物膜内的微生物并呈剂量依赖性。100～300 μmol/L法尼醇对两者混合生物膜抑制率的增长较明显，随着浓度的增加，抑制作用增长幅度逐渐减缓，抑制率趋于稳定。本组的前期研究表明，法尼醇对24 h白念珠菌生物膜的SMIC50为200 μmol/L[34]，在此次实验中，法尼醇对24 h白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜的SMIC50为150 μmol/L。最低抑菌浓度的降低，是否因为白念珠菌和粪肠球菌相互的拮抗作用，增加了白念珠菌的药物敏感性，有待进一步研究。除法尼醇浓度为100 μmol/L以外的其他浓度作用时，相同浓度的法尼醇对48 h的生物膜的抑制率略低于24 h的微生物膜。法尼醇浓度为100 μmol/L时，对48 h的混合生物膜抑制作用强于24 h，且具有统计学意义。Fox等[26]的研究表明多种细菌与白念珠菌混合培养形成生物膜，可诱导白念珠菌大量的基因表达改变。由此，法尼醇浓度为100 μmol/L对48 h的生物膜抑菌作用强于24 h是否与白念珠菌基因表达的改变有关，有待进一步研究探讨。

综上，法尼醇对于白念珠菌和粪肠球菌混合生物膜有一定的抑制作用，在创口感染及牙髓感染方面具有一定的研究前景。