白芍总苷对重症急性胰腺炎大鼠胰腺病理学改变及NF-κB通路的影响

王军，董魁，马立东，李静

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是指由各种原因激活胰酶所引发的胰腺组织自身消化、水肿甚至坏死的一种炎症反应，以急性上腹痛、发热、恶心呕吐及血胰酶升高为主要临床表现，其中15%～20%的AP患者可发展成为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)，SAP具有起病急、进展迅速的特点，目前临床上主要采取抑制胰酶分泌与灭活、抗炎、胃肠减压、纠正体液平衡、镇痛等对症治疗，但病死率仍超过20%[1-2]。

中医药是我国的瑰宝，近年来中医药治疗SAP逐渐得到人们的关注与认可[3]。白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)是中药白芍的活性物质，具有抗炎、抗氧化等多种药理学作用[4]，目前临床上主要用于类风湿关节炎的治疗，既往陈慧永等[5]研究发现TGP对AP大鼠炎症具有抑制作用，胰腺病理改变程度与SAP临床表现及预后密切相关，但TGP对SAP大鼠胰腺病理学改变是否具有保护作用及其机制还有待进一步研究。本实验通过制备SAP大鼠模型，以临床治疗急性胰腺炎一线用药甲磺酸加贝酯(gabexate mesylate，GM)为阳性对照，研究TGP对SAP大鼠胰腺病理学改变及NF-kB通路的影响.

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康成年雄性SD大鼠180只，体质量210～250 g，由河北省实验动物中心提供[SCXK(冀)2018-004]；饲养环境设置：温度(25±1)℃、相对湿度55%～65%、光照黑暗各12 h交替，适应性饲养1周，实验前12 h禁食、自由饮水。

1.2 药物与试剂

TGP购自华润三九医药股份公司(纯度≥93.7%，批号H20190327)；GM购自成都天台山制药有限公司(批号201904013)；牛磺胆酸钠购自美国Sigma-Aldrich公司(批号86339)；淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TUENL试剂盒和TNF-α、IL-1β、IL-6酶联免疫(ELISA)试剂盒购自北京博奥森生物科技有限公司；核因子-κB(NF-κB)、激活型半胱胺酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、c-Jun氨基端激酶(p-JNK)、B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(Bax)购自上海碧云天生物技术有限公司；山羊抗兔IgG二抗、DAB显色试剂盒购自武汉博士得生物工程有限公司。

1.3 主要仪器

E300型电泳仪、TE22型转膜仪(美国Hoefer公司)；Varioskanlux型多功能酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；RM2016型切片机(上海徕卡仪器有限公司)；UV-1200紫外-可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。

1.4 动物分组、造模与给药

1.4.1 分组 180只实验用SD大鼠随机数字编码后，按照随机数字表法随机分为假手术组、SAP组、TGP(20、40、60 mg/kg)组和GM 10 mg/kg组[6]，每组30只。

1.4.2 SAP大鼠模型的制备[7]实施麻醉后取仰卧位，消毒后沿腹正中切口2 cm，暴露并分离十二指肠及胆胰管，夹闭胆胰管后置静脉套管，套管针逆行插入胆胰管约1 cm，以0.1 mL/min的速度注入3.5%牛磺胆酸钠溶液(1 mL/kg)，然后退出导管、缝合切口、归位十二指肠、逐层缝合皮肤并消毒。造模结局判断：检测血清AMS水平，达到正常水平3倍以上即可认定造模成功。假手术组，打开腹腔后即缝合。

1.4.3 给药 精确称取TGP和GM粉末并分别加入适量生理盐水制备浓度为20、40、60 mg/mL的TGP溶液和10 mg/mL的GM溶液，造模完成后，TGP(20、40、60 mg/kg)组和GM (10 mg/kg)组分别尾静脉注射浓度为20、40、60 mg/mL的TGP溶液和10 mg/mL的GM溶液，注射剂量均为1 mL/kg，假手术组和模型组以1 mL/kg同步尾静脉注射给予生理盐水。24 h后行各指标检测。

1.5 胰腺组织外观检查及湿/干比重计算

每组随机取10只大鼠，麻醉后开腹经腹主动脉取血并离心取血清，-20 ℃保存备检；然后取胰腺组织，生理盐水冲洗干净后，肉眼观察胰腺大体外观变化；称重为湿重(W1)，置100 ℃烤箱24 h后称重为干重(W2)，湿/干比重=W1/W2。

1.6 血清AMS、LPS水平检测

取各组大鼠血清，参照试剂盒操作说明，采用比色法通过紫外分光光度计检测各组大鼠血清AMS、LPS水平。

1.7 胰腺组织病理学检查及病变评分

每组随机取10只大鼠，麻醉后开腹取胰腺组织，生理盐水冲洗干净，置4%多聚甲醛溶液固定72 h后，石蜡浸润包埋、4 μm厚度连续切片、透明和脱蜡水化后行常规HE染色(苏木精溶液染色10 min、0.5%尹红乙醇染色1 min、80%乙醇分化3 s后脱水)、中性树胶封片后观察胰腺组织病理学改变。参照Yilmaz等[8]报道的评分标准进行病变评分。①水肿：无水肿现象，计0分；局部小叶间水肿，计1分；弥漫性小叶间水肿，计2分；腺泡细胞水肿，计3分；小叶间明显分离，计4分。②出血：无出血，计0分；实质出血≤25%，计1分；实质出血>25%～≤50%，计2分；实质出血>50%～≤75%，计3分；实质出血>75%，计4分。③感染：无感染，计0分；边缘腺体出现感染，计1分；小叶感染≤50%，计2分；小叶感染>50%～≤75%，计3分；小叶呈现融合或脓肿，计4分。④坏死：无坏死，计0分；导管周围坏死，计1分；局部的实质坏死，计2分；小叶坏死，计3分；弥漫性小叶坏死，计4分。每只大鼠均由两位实验人员独立进行评分，取平均值。

1.8 胰腺细胞凋亡状况

取胰腺组织石蜡切片经透明和脱蜡水化后，参照TUNEL试剂盒操作说明进行染色，50%甘油封片后通过显微镜观察胰腺细胞凋亡状况。AI计算：每只大鼠取5张切片，均随机选取5个互不重叠的视野，由两名实验人员独立计数凋亡细胞数和细胞总数后取平均值，AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.9 胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量检测

各取每组剩余10只大鼠，麻醉后开腹取胰腺组织，生理盐水冲洗、剪碎后加入倍量4 ℃裂解液研磨匀浆，3 500 rpm离心10 min取上清液，然后参照ELISA试剂盒操作方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.10 胰腺组织蛋白表达检测

取胰腺组织匀浆液于4 ℃ 12 000 rpm离心10 min后取上清液，提取总蛋白并测定总蛋白浓度，以30 μg总蛋白量上样，经SDS-PAGE胶电泳分离、湿转法转膜、丽春红染色、5%脱脂牛奶溶液封闭1 h后，滴加NF-κB、Cleaved Caspase-3、p-JNK、bcl-2、Bax、β-actin抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后滴加二抗室温孵育1 h，洗膜后滴加DAB溶液显色；以β-actin为内参，以条带灰度值半定量目标蛋白表达量。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠胰腺组织大体外观

假手术组大鼠胰腺组织质地柔软、光滑、红润，外观未见明显改变；SAP组胰腺体积增大、质地变硬、表面可见皂化斑，胰腺头部水肿、充血，颜色呈黄绿色等改变；经TGP 20、40、60 mg/kg或GM 10 mg/kg治疗能够不同程度改善SAP大鼠胰腺组织大体外观改变；其中TGP 60 mg/kg组胰腺体积、颜色接近假手术组且水肿、皂化斑不明显，效果优于其它组。见图1。

图1 各组大鼠胰腺组织大体外观 A：假手术组；B：SAP组；C：TGP 20 mg/kg组；D：TGP 40 mg/kg组；E：TGP 60 mg/kg组；F-GM 10 mg/kg组

2.2 TGP对SAP大鼠胰腺组织湿/干比重的影响

与假手术组比较，SAP组大鼠胰腺组织湿/干比重明显升高(P<0.01)；与SAP组比较，TGP 40、60 mg/kg组和GM 10 mg/kg组湿/干比重明显降低(P<0.01)；与GM 10 mg/kg组比较，TGP 60 mg/kg组湿/干比重明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3 TGP对SAP大鼠血清AMS、LPS水平的影响

与假手术组比较，SAP组大鼠血清AMS、LPS水平显著升高(P<0.01)，SAP组AMS水平达到假手术组AMS水平3倍以上，可认定造模成功；与SAP组比较，TGP 40、60 mg/kg组和GM 10 mg/kg组AMS、LPS水平显著降低(P<0.05或P<0.01)；与GM 10 mg/kg组比较，TGP 60 mg/kg组AMS、LPS水平显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 TGP对SAP大鼠胰腺组织湿/干比重和血清AMY、LIP水平的影响

2.4 TGP对SAP大鼠胰腺组织病理学改变及病变评分的影响

假手术组大鼠胰腺组织未见异常：着色均匀、小叶结构清楚完整、未见水肿和炎性浸润，细胞形态正常、胞核清晰；SAP组胰腺组织呈现腺小叶间距增大、结构不规则，胰腺细胞坏死，腺泡水肿、破裂，大量炎性细胞浸润，红细胞渗出，胞核固缩等病理学改变；经TGP 20、40、60 mg/kg或GM 10 mg/kg治疗能够不同程度改善SAP大鼠胰腺组织上述病理学改变；其中TGP 60 mg/kg组效果优于其它组。病变评分结果：与假手术组比较，SAP组大鼠胰腺组织病变评分显著升高(P<0.01)；与SAP组比较，TGP 40、60 mg/kg组和GM 10 mg/kg组病变评分显著降低(P<0.01)；与GM 10 mg/kg组比较，TGP 60 mg/kg组病变评分显著降低P<0.05)。见表2和图2。

表2 TGP对SAP大鼠胰腺组织病变评分的影响 [M(Q1-Q3)，分]

图2 TGP对SAP大鼠胰腺组织病理学改变的影响(HE，×200倍) A：假手术组；B：SAP组；C：TGP 20 mg/kg组；D：TGP 40 mg/kg组；E：TGP 60 mg/kg组；F：GM 10 mg/kg组

2.5 TGP对SAP大鼠胰腺细胞凋亡的影响

假手术组大鼠胰腺组织可见极少量凋亡细胞；与假手术组比较，SAP组胰腺凋亡细胞数量显著增多、AI显著升高(P<0.01)；与SAP组比较，TGP 20、40、60 mg/kg组和GM 10 mg/kg组胰腺凋亡细胞数量呈不同程度增多，AI显著升高(P<0.01)；与GM 10 mg/kg组比较，TGP 60 mg/kg组胰腺凋亡细胞数量显著增多、AI显著升高(P<0.01)。见图3和表3。

图3 TGP对SAP大鼠胰腺细胞凋亡的影响 A：假手术组；B：SAP组；C：TGP 20 mg/kg组；D：TGP 40 mg/kg组；E：TGP 60 mg/kg组；F：GM 10 mg/kg组

表3 TGP对SAP大鼠胰腺组织病变评分和胰腺细胞AI的影响

2.6 TGP对SAP大鼠胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

与假手术组比较，SAP组大鼠胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.01)；与SAP组比较，TGP 40、60 mg/kg组和GM 10 mg/kg组TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。与GM 10 mg/kg组比较，TGP 60 mg/kg组TNF-α、IL-1β水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表4。

2.7 TGP对SAP大鼠胰腺组织NF-κB、cleaved caspase-3、p-JNK、bcl-2、Bax表达及Bax/bcl-2表达比值的影响

与假手术组比较，SAP组大鼠胰腺组织NF-κB、bcl-2表达上调而cleaved caspase-3、p-JNK、Bax表达下调(P<0.01)，Bax/bcl-2表达比值显著降低(P<0.01)；与SAP组比较，TGP 40、60 mg/kg组和GM 10 mg/kg组NF-κB、bcl-2表达下调且cleaved caspase-3、p-JNK、Bax表达下调(P<0.05或P<0.01)；与GM 10 mg/kg组比较，TGP 60 mg/kg组NF-κB表达下调且cleaved caspase-3、p-JNK表达上调(P<0.05或P<0.01)，Bax/bcl-2表达比值显著升高(P<0.05)。见图4和表5。

表4 TGP对SAP大鼠胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

图4 TGP对SAP大鼠胰腺组织NF-κB、Cleaved Caspase-3、p-JNK、bcl-2、Bax表达的影响 A：假手术组；B：SAP组；C：TGP 20 mg/kg组；D：TGP 40 mg/kg组；E：TGP 60 mg/kg组；F：GM 10 mg/kg组

3 讨论

近年来，随着国家振兴中医药战略的实施，人们对中医药的认可度逐渐升高，中药治疗SAP也逐渐得到关注。SAP在中医属于“腹痛”、“胃脘痛”、“脾心痛”、“胁痛”等范畴，情志不畅、肝失疏泄、肝气郁滞、日久花火化瘀为SAP主要病理。白芍为毛茛科植物芍药的干燥根，为我国传统中药品种，《本经》、《别录》等医学典籍中均有记载，味苦、性微寒，具有养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳之功效，用于血虚萎黄、胁痛，腹痛、四肢挛痛、头痛眩晕等症的调治。TGP为中药白芍的主要活性成分，目前临床上主要用于类风湿关节炎的治疗，本实验采用逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠的方法制备SAP大鼠模型，血清AMS水平超过正常水平3倍，LPS水平超过正常水平11倍，证实SAP大鼠模型造模成功；SAP大鼠胰腺组织呈现质地变硬、表面可见皂化斑、水肿、充血、颜色呈黄绿色等外观变化，呈现腺小叶间距增大、细胞坏死、腺泡水肿破裂、大量炎性细胞浸润、胞核固缩等病理学改变，与徐玲玲等[9]研究报道一致。实验结果显示，经TGP或GM治疗能够有效抑制SAP大鼠胰腺组织大体外观变化，降低湿/干比重和血清AMS、LPS水平，明显改善胰腺组织组织病理学改变并降低病变评分，抑制胰腺细胞凋亡、显著降低AI，并且TGP 60 mg/kg组效果优于GM 10 mg/kg组，提示TGP对SAP大鼠胰腺病理学改变具有保护作用。

表5 TGP对SAP大鼠胰腺组织NF-κB、cleaved caspase-3、p-JNK、bcl-2、Bax表达及Bax/bcl-2表达比值的影响

炎症反应是各种病因所致SAP的共同通路，是SAP致死主要原因之一。任辉邦等[10]研究发现SAP初期胰腺组织即可出现炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，能够破坏腺泡导致胰腺组织损伤；TNF-α和IL-1β为趋化因子，能够诱导自身及其他炎症因子合成与释放而诱发炎症级联反应，IL-6做为趋化因子则能够直接激活炎症细胞并放大炎性级联反应，从而进一步加重胰腺组织损伤。本研究发现，经TGP 或GM治疗能够有效降低SAP大鼠胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平，并且TGP 60 mg/kg对TNF-α、IL-1β调控作用优于GM 10 mg/kg，提示TGP对SAP大鼠炎症反应具有抑制作用。

坏死和凋亡是细胞死亡的两条主要途径，细胞坏死过程包括胞膜破裂溶解、细胞内容物释放并伴随剧烈的炎症反应；细胞凋亡是一种受多种基因调控的程序性自主死亡过程，与细胞坏死最大的区别是不引发炎症反应，Xu P等[11]、周翔宇等[12]研究发现SAP炎症反应程度与腺泡细胞凋亡呈负相关，细胞凋亡对SAP临床转归有利。caspase家族和Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中发挥着重要调控作用，其中caspase-3被细胞色素C等刺激因子激活后(cleaved caspase-3)诱导细胞凋亡的启动和促进细胞凋亡的执行；bcl-2和Bax同属于Bcl-2家族，bcl-2具有保护线粒体膜、抑制细胞色素C释放和caspase蛋白激活等生理作用，表现出抗凋亡作用，而Bax则具有促凋亡活性，bcl-2和Bax能够形成异源二聚体而双双失活，因此Bax/bcl-2表达比值能够反映二者对细胞凋亡带来的调控作用[13]。p-JNK表达水平能够反映内质网应激活性，内质网应激是促进细胞凋亡的另一条重要途径[14-15]。本研究发现，经TGP 或GM治疗能够明显上调cleaved caspase-3、p-JNK、Bax表达并明显下调bcl-2，提高Bax/bcl-2表达比值，并且TGP 60 mg/kg对Cleaved Caspase-3、p-JNK表达的调控作用优于GM 10 mg/kg，提示TGP对SAP大鼠胰腺细胞凋亡的抑制作用可能与TGP影响凋亡相关蛋白表达有关。

NF-κB信号通路在SAP疾病进展过程中发挥着重要的调控作用[16-17]，NF-κB能够调控含有κB位点的下游分子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6等，徐宝琪等[18]研究发现通过药物抑制NF-κB活性能够显著降低SAP患者血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，减低炎症反应。此外，NF-κB能够间接促进Bcl-2家族中抗凋亡蛋白bcl-2表达，但Bax不具备κB位点而不受NF-κB调控，NF-κB还能够抑制caspase-3和p-JNK活化，从而表现出抑制细胞凋亡的作用[19-20]。本研究发现，经TGP 或GM治疗能够显著下调NF-κB表达，并且TGP 60 mg/kg对NF-κB表达的调控作用优于GM 10 mg/kg，提示TGP对SAP大鼠胰腺炎症反应的抑制和细胞凋亡的促进作用可能与抑制NF-κB信号通路有关。

综上所述，TGP具有改善SAP大鼠胰腺病理学改变的作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路而抑制炎症反应、促进胰腺细胞凋亡有关；但TGP对Bax表达的调控作用机制还有待于进一步研究。