香菇多糖对膀胱癌细胞增殖和迁移行为的影响

游文杰，张人杰，周芬芳，郭紫成，王子健，王行环

(1.武汉大学中南医院泌尿外科，湖北武汉 430071；2.湖北省人类遗传资源保藏中心，湖北武汉 430071；3.恩施土家族苗族自治州中心医院泌尿外科，湖北恩施 445000)

膀胱癌(bladder cancer，BCa)是具有高发病率和死亡率的泌尿系肿瘤，增殖和迁移在膀胱癌复发和转移等进程中占据着重要的地位。近20年来，BCa的致病因素仍未充分阐明，治疗难度很大，临床上以术中切除和术后放疗等为代表的一线治疗方案均难以进一步延长患者生存期[1]。在此背景下，膀胱癌化疗，特别是术前新辅助化疗逐步得到重视[2]，并在基础研究和临床转化中取得了系列进展[3]。香菇多糖提取自香菇子实体，其主要成分为β-(1，3)-D葡聚糖[4]。由于可增强患者对顺铂和吉西他滨等化疗药物的敏感性，香菇多糖已在肝癌、卵巢癌等肿瘤联合化疗中得到临床应用[5]。目前，香菇多糖对人膀胱癌的治疗效果仍有待进一步研究。本研究采用不同浓度香菇多糖处理膀胱癌UM-UC3细胞，初步探讨了香菇多糖抑制膀胱癌细胞增殖和迁移的作用及机制，旨在为临床转化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料膀胱癌UM-UC3细胞系购自中国科学院上海典型培养物保藏中心。香菇多糖购自上海Sigma-Aldrich贸易有限公司。DMEM高糖培养基、胎牛血清( fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco生物有限公司。GAPDH、Ki67、CDK2、CDK6、P53、N-cadherin、Vimentin一抗及相应二抗购自上海Abcam贸易有限公司。细胞周期染色试剂盒、ECL化学发光液等购自武汉沃莱邦德贸易有限公司。

1.2 细胞培养及传代将UM-UC3细胞培养于DMEM高糖完全培养基(含体积分数10%的FBS)中，在37 ℃，体积分数5%的CO2条件下培养至体积分数为80%的汇合度。用体积分数0.25%胰酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min后按照1∶3的密度传代。

1.3 噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)实验以3×103个/孔的密度接种UM-UC3细胞于96孔组织培养板内。24 h后弃去原有培养基，向每孔中加入200 μL含不同浓度香菇多糖的完全培养基。24 h和48 h 后分别向每孔中加入20 μL MTT试剂 (5 mg/mL)并继续培养4 h。弃去培养基，向每孔中加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，避光混匀后使用多功能酶标仪(SpectraMax，USA)检测490 nm处的吸光度。

1.4 流式细胞术用低质量浓度(20 μg/mL)和高质量浓度(60 μg/mL)香菇多糖处理UM-UC3细胞48 h。消化并收集细胞沉淀，加入1 mL磷酸盐缓冲液重悬细胞，3 000 r/min离心5 min。弃去上清，依次加入1 mL DNA染色缓冲液和10 μL碘化丙啶(PI)溶液。室温下避光孵育30 min后使用流式细胞仪(Beckman，USA)检测细胞内DNA含量。

1.5 Transwell实验用无血清DMEM高糖培养基重悬处理后的UM-UC3细胞，并将细胞密度调整至2×105个/mL。采用直径8 μm的Transwell小室(Corning，USA)进行细胞迁移实验[6]。上室加入200 μL细胞悬液，下室加入700 μL完全培养基。静置培养24 h后依次采用40 g/L多聚甲醛固定和1 g/L结晶紫染色。冲洗多余的结晶紫，用棉签轻拭去上室非迁移细胞，利用倒置荧光显微镜(Leica，German)观察细胞并拍照。

1.6 细胞划痕实验将处理后的UM-UC3细胞消化后接种于6孔组织培养板内，待汇合度>90%时利用200 μL移液枪头在培养板底垂直划痕。洗净未贴壁细胞，加入含体积分数为2% FBS的低血清培养基培养24 h后观察划痕宽度并拍照。

1.7 Western blot实验采用裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂提取细胞蛋白，并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。取等量蛋白质进行10 g/L SDS-PAGE电泳，浓缩时电压设为80 V，分离时电压设为120 V。电泳后进行转膜，其参数设为固定电流270 mA，时间100 min。PVDF膜用50 g/L脱脂奶粉封闭后一抗孵育过夜，加入二抗继续孵育2 h。采用化学发光成像系统(Bio-Rad，USA)检测蛋白质条带。

1.8 免疫荧光分析制作细胞爬片，用40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min后再用体积分数为0.3%的Triton X-100室温下孵育20 min增加细胞膜通透性。随后进行抗体结合反应，先用体积分数为10%的山羊血清封闭爬片1 h，然后一抗孵育过夜，加入荧光二抗继续孵育1 h，DAPI溶液染细胞核10 min后封片。利用倒置荧光显微镜观察荧光并拍照。

2 结 果

2.1 香菇多糖抑制膀胱癌UM-UC3细胞增殖采用MTT实验初步筛选香菇多糖的最适给药浓度，并进一步通过流式细胞术验证香菇多糖对膀胱癌细胞增殖的抑制效果。如图1A所示，将空白组(0 μg/mL)相对细胞活力设定为100%，则10、20、40、60、80、100 μg/mL组的24 h相对细胞活力分别为(93.7±5.1)%、(76.1±4.9)%、(59.2±3.9)%、(50.4±3.0)%、(31.8±2.4)%，48 h相对细胞活力分别为(89.9±4.9)%、(79.4±4.1)%、(66.4±4.1)%、(49.9±4.9)%、(43.4±2.6)%、(25.8±1.3)%。在此基础上，我们选取0 μg/mL作为空白组、20 μg/mL作为低质量浓度组、60 μg/mL作为高质量浓度组进行后续实验。如图1B、C所示，与空白组(53.2±2.1)%相比，低质量浓度组和高质量浓度组中G0/G1期细胞比例分别上升至(57.2±0.9)%和(67.9±0.5)%，差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，Ki67免疫荧光强度随香菇多糖浓度上升而呈现降低趋势。综上所述，香菇多糖可显著抑制膀胱癌UM-UC3细胞增殖，其机制可能与G0/G1期细胞周期阻滞有关。

2.2 香菇多糖抑制膀胱癌UM-UC3细胞迁移Transwell实验的结果如图2A、C所示，空白组、低质量浓度组和高质量浓度组迁移细胞数分别为(308±30)、(222±27)、(86±12)个。划痕迁移实验结果如图2B、D所示，空白组、低质量浓度组、高质量浓度组24 h划痕愈合率分别为(56.2±2.4)%、(44.2±4.2)%、(19.4±2.9)%。与空白组比较，低浓度组和高浓度组细胞迁移能力受到显著的抑制(P<0.05)，并呈现出明显的剂量依赖性。

A：不同质量浓度(0、10、20、40、60、80、100 μg/mL)香菇多糖处理24 h和48 h后膀胱癌UM-UC3细胞的增殖活力；B：不同质量浓度香菇多糖(0、20、60 μg/mL)处理UM-UC3细胞48 h后，细胞周期G0/G1期细胞比例显著上升；C：细胞周期的流式结果图，同时免疫荧光提示UM-UC3细胞内Ki67蛋白表达随香菇多糖质量浓度上升呈现下降趋势。*P<0.05，***P<0.001。

A、C：不同质量浓度(0、20、60 μg/mL)香菇多糖对UM-UC3细胞Transwell迁移能力的抑制效果；B、D：香菇多糖抑制UM-UC3细胞的划痕迁移能力。随香菇多糖质量浓度上升，UM-UC3细胞的迁移细胞数和划痕愈合率均显著降低。与对照组相比，差异均具有统计学意义。**P<0.01，***P<0.001。

2.3 香菇多糖参与调控细胞周期和上皮间充质转化通路Western实验结果如图3所示。经不同质量浓度香菇多糖处理后，膀胱癌UM-UC3细胞中周期上皮间充质转化基因(N-cadherin、Vimentin)和周期相关基因(CDK2、CDK6)蛋白表达明显下调，原癌基因P53蛋白表达增加。该结果表明：香菇多糖可能通过阻滞细胞周期和抑制上皮间充质转化途径从而抑制膀胱癌细胞增殖和迁移。

图3 免疫印迹分析蛋白标志物表达情况

3 讨 论

新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy，NAC)是肌浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)患者在接受根治性手术前进行的化疗。NAC在提高MIBC患者耐受性、减灭微小转移灶、预防复发和转移、改善预后和5年生存期等方面具有显著的效果，且已被欧洲泌尿外科指南列为T2-T4cN0M0期患者的优选治疗方式(A类推荐)[7]。临床常用的膀胱癌化疗药物包括顺铂、吉西他滨、长春新碱和甲氨蝶呤等，但尚无一种化疗药物及其组合物能完全满足临床需求[8]。因此，筛选新型化疗药物，丰富备选化疗药物在扩展新辅助化疗适应证、提升化疗效果、减少耐药性产生等方面具有一定的战略意义。

湖北省人类遗传资源保藏中心是华中地区在建规模最大的生物样本库，目前已获批国际生物与环境样本库协会保藏资质。中心可为高通量药物筛选及分子诊疗等转化医学研究提供高质量的肿瘤样本和信息服务。前期工作中，我们基于临床需求筛选得到香菇多糖、辣椒素、二氢杨梅素等具有优异抗肿瘤活性的植物源性药物，并进一步验证了其作用效果和机制。马莉等[9]报道香菇多糖可通过PI3K/AKT信号途径诱导白血病细胞凋亡。李静等[10]将香菇多糖首次应用于肺癌联合化疗，有效的提高了患者的免疫力，减轻了不良反应。值得一提的是，目前香菇多糖在膀胱癌中的基础研究报道较少，临床试验仍未见报道。

本研究中，我们采用MTT、流式细胞术和免疫荧光等实验揭示了香菇多糖抑制膀胱癌UM-UC3细胞增殖和迁移的效果。经香菇多糖处理后，UM-UC3细胞周期成功阻滞于G0/G1期，Ki67蛋白荧光强度明显下调，迁移细胞数和划痕愈合率均得到显著降低(P<0.05)。进一步采用不同浓度香菇多糖处理膀胱癌细胞可有效抑制上皮间充质转化基因(N-cadherin、Vimentin)和周期相关基因(CDK2、CDK6)的蛋白表达，上调原癌基因P53的蛋白表达。上皮间充质转化是膀胱癌细胞获取高迁移和侵袭能力的基础，其生物学功能得到广泛报道[11-12]。本研究结果表明：香菇多糖可能是通过阻滞细胞周期和抑制上皮间充质转化途径，从而达到抑制膀胱癌细胞增殖和迁移的效果。

综上所述，香菇多糖具有优异的体外抗肿瘤活性。香菇多糖的体内抗肿瘤活性以及生物安全性等有待后续进一步的研究。香菇多糖来源广泛，抗肿瘤效果好，毒副作用小，有望顺利申请一项Ⅰ类新药，并推广应用于膀胱癌新辅助化疗[13-14]。