五味子内生拮抗菌JYg07菌株的促生防病作用

曹丽娟，金 岩，由士江

(北华大学林学院，吉林 吉林 132013)

利用拮抗菌防治植物病害是生物防治发展的主要方向，其首要问题是获得更多的拮抗菌资源.从植物体内分离、筛选内生拮抗菌已成为丰富拮抗菌资源库的重要途径，目前，已经从多种植物中分离出具有拮抗作用的内生细菌.作为植物病害生物防治的新成员，内生细菌已成为研究热点[1].在植物体内，内生细菌不仅能帮助植物抵抗病原菌侵染，还可以充分发挥固氮作用，具有增加株高、干重，增强长势等促生作用[2].刘永红等[3]在研究药用阿魏植物内生细菌促生作用时发现，部分菌株具有固氮潜力；阳湖荣等[4]发现，白术内生细菌中的菌株AMR83同时具有固氮、溶磷、解钾和合成吲哚乙酸的潜力；傅本重等[5]试验发现，核桃内生细菌XHE8菌株不仅对红苋菜种子发芽、芽长生长和根长生长有促进作用，而且对测试的12个植物病原真菌具有拮抗作用；林星辰等[6]发现，从人参中分离的内生菌B69 菌株对人参根腐病有较好的防治效果.由上可见，植物内生细菌对植物病原菌具有拮抗活性，不仅不会对植物产生危害，还能促进植物生长.

近年来，随着五味子栽培面积的逐步扩大，除了常发病害(如叶枯病、根腐病、黑斑病、白粉病等)逐年加重[7]外，也不断出现一些新的病害，大大影响了五味子的品质与产量.自2007年薛彩云等[8]初次报道五味子茎基腐病以来，其危害越来越严重.该病会造成植株茎基腐烂、皮层脱落，直至植株枯死，是五味子栽培中的毁灭性病害.目前，中草药种植户防治病害还主要依赖于化学药剂，常出现滥用高毒农药的情况，造成中草药农残超标，影响了中草药的品质，收入减少.因此，研究安全有效的生物防治措施已成为科研的努力方向.金岩等[9]已从五味子植株中分离筛选出拮抗活性较强的菌株——JYg07，并证实菌株JYg07可以稳定地在五味子体内定殖[10].本次试验进一步研究菌株JYg07的促生作用和对五味子茎基腐病的生物防治作用，测定其对供试植物的潜在促生能力，以及在温室和田间的防病能力，从而评估该拮抗菌的应用价值，为下一步开展五味子内生拮抗菌抗病机制研究，以及菌剂开发与利用奠定基础.

1 材 料

1.1 供试植物

水稻(OryzasativaL.)、大豆(Glycinemax(L.) Merr)、玉米(ZeamaysLinn.Sp)、番茄(LycopersiconesculentumMill)、辣椒(CapsicumannuumL.)，以上植物种子均在吉林市种子商店购买；五味子(Schisand-rachinensis(Turcz.)Baill)植株由吉林农业科技学院药用植物园郑永春副教授提供.

1.2 供试菌株

五味子内生拮抗菌株JYg07(Bacillusthuringiensis)由北华大学林木病理实验室提供，从五味子根部分离获得；五味子茎基腐病病原菌——尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)由吉林农业大学病理实验室提供.

1.3 供试土壤

供试土壤由北华大学土壤实验室提供，经过干热灭菌(170 ℃，2 h)后备用.

1.4 供试培养基

菌种培养：牛肉膏蛋白胨培养基(NA)；液体培养：不加入琼脂的NA液体培养基(NB)；病原菌培养：马铃薯蔗糖培养基(PDA).上述培养基(pH为7.0～7.2)均在0.1 MPa、121 ℃下灭菌30 min，检查无菌后使用.

2 方 法

2.1 供试菌液制备

2.1.1 JYg07菌株活化

用无菌接种环自保存的JYg07菌种斜面上挑取菌体，在NA固体培养基上划线培养(25 ℃，24 h)，活化菌种.

2.1.2 JYg07菌发酵液制备

将活化好的菌株接入NB液体培养基中(25 mL/100 mL三角瓶)，振荡培养24 h(25 ℃，150 r/min)后再取1 mL培养液接入NB液体培养基中(100 mL/500 mL三角瓶)，振荡培养48 h(25 ℃，150 r/min).将制得的发酵液以无菌水稀释10倍、50倍、100倍.

2.2 供试种子预处理

将供试种子用洁净纱布包好后进行温汤浸种(55～58 ℃左右)15 min，转至清水中浸泡4 h，晾干后备用.

2.3 发酵液对供试植物种子萌发和幼芽生长的影响

选取处理过的种子各20粒，分别置于不同浓度的发酵液中，浸泡24 h后移至铺有无菌滤纸的无菌培养皿中保湿培养(滤纸始终保持湿润状态).每个处理3次重复，以无菌水(CK)浸泡作为对照.在25 ℃恒温培养箱中培养，分别统计24 h和48 h发芽情况，计算萌发率.用游标卡尺测量96 h后发芽种子的胚根和胚轴长度，并称鲜重.

2.4 发酵液浸种对植物出苗的影响

以JYg07菌株10倍发酵液和清水(CK)浸泡供试植物种子，分别于24 h后播于装有无菌土壤的营养钵(12 cm×12 cm×12 cm)中.每钵播15粒，每个处理重复3次，出苗后统计最初出苗率(第一批出苗)，记录全部出苗时间.

2.5 不同处理发酵液对植物生长的影响

将处理后的供试植物种子播于装有无菌土壤的营养钵中，每钵15粒.待出苗15 d后，选择长势、大小比较一致的植株移栽至装有等量无菌沙壤土的塑料花盆(体积为0.21 cm3)中，每钵1株.按照不同处理(发酵液浸种、发酵液浇灌、发酵液浸种+浇灌3种方式)用JYg07发酵液和清水浇灌，每个处理3次重复，30 d后测量株高、根系长度和鲜重.

2.6 拮抗菌JYg07侵染性

拮抗菌JYg07活化培养24 h后以无菌水配制菌悬液备用.选取健康五味子植株，用接种针灭菌后针刺五味子叶片、茎、茎基，制造伤口.以喷雾形式将菌悬液喷到针刺后的五味子植株上，保湿48 h，观察侵染情况.以喷无菌水作为对照.

2.7 拮抗菌JYg07防治五味子茎基腐病

2.7.1 罹病植株的防治

将五味子茎基腐病病原菌菌种移至PDA平板上培养(25 ℃)至菌丝布满平板.选择长势良好、无病害发生的健康植株，用无菌解剖刀在茎基部轻轻划出几条伤口，用无菌挑针挑取培养平板上的菌丝覆盖到伤口上，用保鲜膜包裹好，7 d后持续观察，直至确认发病后进行防治试验.

用JYg07稀释10倍发酵液对100株发病五味子植株进行灌根(每株50 mL)，每隔7 d浇灌1次，共4次，以清水浇灌作为对照.在浇灌后的第7、14、21、28天分别调查茎基发病情况，按文献[11]中五味子茎基腐病病害分级标准，统计发病株数及发病等级，按照下式计算病情指数及防治效果.

病情指数=∑(各级病株数×病级数)/(调查总株数×最高病级数)×100，

防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100%.

2.7.2 病害预防

选取健康的五味子植株，分作5个处理，在20 d内依次浇灌JYg07稀释10倍发酵液.浇灌次数为5、4、3、2、1次，每次间隔4 d.按照2.7.1中的接种方式接种病原菌，以清水浇灌为对照.每个处理20株，3次重复.视土壤湿度情况，各处理适当浇灌清水，以补充水分.在第7、14、21、28天统计发病株数及发病等级，计算防治效果，方法同上.

2.7.3 田间防治

在吉林市丰满区旺起镇五味子栽培区选择100株发生茎基腐病的植株，分作5个处理：处理1，每隔7 d浇灌1次发酵液，共浇4次；处理2，浇灌3次发酵液，间隔7 d，另外1次换作清水浇灌；处理3，浇灌2次发酵液，间隔7 d，另外2次换作清水浇灌；处理4，浇灌1次发酵液，另外3次换作清水浇灌；处理5，浇灌清水4次.每次每株浇50 mL，浇灌结束后，在5、10、15 d后进行田间病害调查，记录每个区域的发病株数及病情等级，同上述方法计算防治效果.

3 结果与分析

3.1 内生拮抗菌JYg07对种子发芽的影响

菌液浸泡对种子萌发的影响见表1.由表1可见：处理24 h，发酵原液处理的种子萌发率均低于发酵液稀释处理种子和对照种子的萌发率，说明发酵原液对种子萌发有轻微的抑制作用，10倍发酵液、50倍发酵液、100倍发酵液处理种子的萌发率普遍高于对照种子的萌发率；处理48 h，各处理种子的萌发率均大于98%，10倍发酵液、50倍发酵液处理种子的萌发率在99.5%以上，说明内生拮抗菌JYg07发酵液不会影响种子的最终萌发，发酵液稀释10倍、50倍要优于稀释100倍.

表1 菌液浸泡对种子萌发的影响

处理96 h后测量胚根和胚轴长度，结果见表2.由表2可见：经过菌液浸泡后，10倍发酵液对供试种子胚根和胚轴生长的促进作用均比其他处理有显著提高，只有水稻的胚轴长度较50倍处理的略低；发酵原液处理的胚根和胚轴长度比对照低.总体看来，内生拮抗菌JYg07发酵稀释液表现的促生作用与发酵液稀释倍数有很大关系.稀释100倍会影响促生作用，可能是JYg07在发酵过程分泌了一些有促生作用的代谢物质，而发酵原液的菌体浓度和代谢物质浓度过高，反而会抑制植物种子发芽.因此，后续采用JYg07菌株的10倍发酵液进行试验.

表2 菌液浸泡对幼芽生长的影响

3.2 发酵液浸种对出苗的影响

用10倍发酵液浸种，在室内营养钵中播种，观察出苗情况，结果见表3.由表3可见：内生拮抗菌JYg07菌株发酵稀释液浸泡对所有供试种子的最初出苗率均有影响，出苗率均低于对照，但全部出苗时间差别不大.其中，玉米、辣椒、水稻与对照的全部出苗时间一致，番茄较对照延迟1 d，大豆比对照提前1 d.由此可见，虽然菌株发酵稀释液对种子出苗前期有一定抑制作用，但并未影响最终出苗，这与发芽试验结果一致.菌液浸种对出苗的影响只在时间上略有不同，不会影响出苗率.

表3 菌液浸泡对出苗的影响

3.3 不同处理方式对生长的影响

3种处理方式(发酵液浸种、发酵液浇灌、发酵液浸种+浇灌)供试植物的生长情况见图1.由图1可见：浇灌和浸种+浇灌对供试植物生长有比较明显的促进作用，浸种+浇灌的方式效果最好.从增长率看，浸种+浇灌对根系长度影响最大，其中，玉米的根系长度增长率最高，达到40.0%；大豆最低，为23.0%；番茄、水稻、辣椒分别增长了35.3%、32.2%、25.0%.浸种+浇灌对株高也有明显影响，番茄的株高增长最多，增长率达到35.0%；大豆增长最少，增长率仅为9.1%；辣椒、玉米、水稻分别增长了25.0%、23.1%、20.8%.浸种+浇灌对鲜重的影响最小，增长率均较低，增长最多的是番茄，增长率也只有13.6%；辣椒最低，增长率为4.1%；玉米、水稻、大豆分别增长了11.3%、10.5%、9.6%.发酵液浇灌后，供试植物的株高、根系长度、鲜重也有所增长，但增长率都低于浸种+浇灌处理，而且，番茄株高、辣椒鲜重不但没有增长反而有所下降.浸种处理对供试植物的生长基本没有促进作用，除了水稻的株高表现出少许增长外，其余均低于对照.通过对植物生长的持续观察发现，菌液浇灌的植株叶片颜色较对照更浓绿.

不同小写字母表示0.05水平差异显著.

3.4 拮抗菌JYg07的侵染性

伤口是细菌侵染植物的主要通道，在足够的湿度条件下，经过针刺植株接种拮抗菌JYg07后发现，五味子植株针刺处没有病斑产生，未出现侵染现象，并且与清水对照表现一致，说明分离自五味子植株根部的拮抗菌JYg07对五味子植株没有侵染活性，不是致病菌.

3.5 拮抗菌JYg07对罹病植株的防治效果

在温室下，以JYg07稀释10倍发酵液对发病五味子植株进行灌根，测定防治效果，结果见表4.由表4可知：JYg07发酵液对五味子茎基腐病有一定的防治效果，并且随着浇灌次数的增加，防治效果呈逐步上升趋势，防治效果由从第7天的32.34%升至第28天最高的55.77%.

表4 菌株JYg07对五味子茎基腐病的防治效果

图2 不同浇灌次数的防治效果

3.6 病害预防效果

预先对健康的五味子植株浇灌菌株发酵液，5个处理浇灌次数依次减少，再接种病原菌，结果见表5.由表5可知：经过发酵液浇灌的植株发病率比对照低.从防治效果看，提前用发酵液浇灌对病害发生有一定的防治效果，而且有随着浇灌次数增加防治效果逐渐递增的规律.在浇灌后立即接种病原菌的处理(即浇灌1次)，防治效果在第28天仅有12.83%；浇灌2次、3次、4次的，在第28天防治效果分别为16.19%、20.44%、30.22%；浇灌5次的防治效果最佳，在28天时达到44.12%.由此说明，发酵液提前浇灌菌液对病害有一定的预防作用，浇灌次数也会影响防治效果.从时间看(图2)，随着时间的延长，防治效果也逐渐增加，浇灌1次、2次、3次的处理第7、14、21天防治效果变化不明显，在第28天时才有明显提升；浇灌4次、5次的处理则由第7天至28天防治效果持续上升，较其他处理高.

表5 提前浇灌菌液对病害的影响

3.7 田间防治效果

以菌株发酵液对五味子茎基腐病发病植株进行不同次数浇灌，在第5、10、15 天调查发病情况，结果见表6.由表6可知：无论浇灌几次，田间的实际防治效果均低于温室内防治效果.浇灌1次、2次处理的最高防治效果均在第5天，分别为10.39%和3.38%，随着时间的延长，防治效果逐渐下降，在第15天时，防治效果降至1.00%和5.67%；浇灌3次、4次处理的防治效果先升后降，在第10天时，防治效果达到最高，但也仅为34.16%和27.67%，低于室内防治效果.田间防治效果显示，多次浇灌拮抗菌JYg07发酵液能够起到一定的防治效果，应该是菌株在五味子植株体内定殖，抑制了病原菌在植株体内的扩展，但这种防治效果的持续性不理想.随着时间的延长，防治效果出现下降的趋势，并且田间防治效果要低于室内防治效果，很可能是田间的开放环境与室内的温度、营养有一定差别，使得菌株的生长、繁殖受到影响，抑制了拮抗菌作用的发挥.

表6 JYg07菌株发酵液对五味子茎基腐病的田间防治效果

4 小结与讨论

植物内生细菌与植物之间的关系就如同人与肠道菌群的关系，是一种互惠互利的共生关系.内生细菌通过在植物体内的定殖获取生存所必需的营养，由于内生细菌的存在，植物能够抵抗或抑制病原菌的侵入.有些内生细菌还具有固氮作用，帮助植物获得更多的氮源[12].此外，内生细菌通过自身的代谢活动对植物生长也会产生一定的促进作用，已有很多学者通过大量试验予以证明.本研究以五味子内生拮抗菌JYg07的发酵原液，发酵液稀释10倍、50倍、100倍，清水分别处理供试种子.从种子萌发率和出芽情况看，发酵原液要低于其他处理.其中，发酵液稀释10倍、50倍的促生作用最明显，100倍的促生作用有所下降，说明分离到的内生拮抗细菌JYg07的发酵液原液会抑制种子萌发，经过稀释后能够促进植物种子萌发和出芽，但稀释达到100倍时，作用明显下降.刘晓峰等[13]在研究曼陀罗内生细菌对谷子的促生作用时也证实，分离到的内生拮抗细菌MY1的促生作用随着发酵液稀释倍数的增大先升后降；吴佳雯[14]开展的蜡样芽孢杆菌NJSZ-3对马尾松种子萌发的影响实验显示，该菌可以促进马尾松种子萌发，并且100倍稀释液效果最好.由此可见，菌株发酵液的稀释倍数对植物种子的萌发会有影响.

本研究利用五味子内生拮抗菌JYg07稀释10倍发酵液浸种，观察种子出苗情况.结果显示，菌液浸泡后，供试种子最初出苗率均略低于对照，但最终都会全部出苗，在出苗时间上不同种子之间会有差异：玉米、辣椒、水稻与对照一致，番茄较对照晚，大豆比对照要早.由此可见，菌液浸种不会抑制种子出苗，只是不同植物在全部出苗时间上略有不同，不会影响出苗率.朱诗苗[15]采用菌液浸种的方式研究了IAA促生菌对烟草种子萌发的影响，发现菌液浸种不会抑制种子萌发，不影响出苗率，与本研究的结果一致.

进一步探讨了内生拮抗细菌JYg07的促生作用，采用发酵液浸种、发酵液浇灌、发酵液浸种+浇灌3种处理方式在室内种植供试种子，观察植物生长情况.从株高、根长看，采用发酵液浸种+浇灌处理的促生作用比较明显，与对照相比有较大提高，但鲜重增长率没有株高和根长大.发酵液浇灌处理在株高、根长和鲜重上也表现出了一定的增长率，但远低于发酵液浸种+浇灌处理.发酵液浸种处理在株高和鲜重方面均低于对照，根长比对照略有增加.因此，在发酵液使用方法上，可以考虑采用发酵液浸种+浇灌的方式.在研究内生细菌促生作用时，多数学者采用的方法是灌根[16-17].本次试验从种子播种时就使用菌液处理，再结合灌根，使内生细菌持续与植物相适应，提早定殖，可以更好地发挥其促生作用.

在确定内生拮抗菌株JYg07对五味子植株不具有致病性后，利用菌株10倍发酵液对发生五味子茎基腐病的植株进行了室内防治、抗病能力以及田间防治3个试验，探讨了内生拮抗菌株JYg07的生物防治作用.结果发现，对已发病植株浇灌菌液后，最终防治效果达到了55.77%.浇灌菌液也能够提高植株对茎基腐病的抵抗力，并且随着浇灌次数的增加，抗性也逐渐增强，因此，提前多次浇灌菌液可以有效预防五味子茎基腐病的发生.在大田，利用菌液浇灌的防治效果不理想.浇灌4次的处理在第10天防治效果最高，但也仅有34.16%，并且15 d的防治效果又有所下降，其他处理的防治效果均较低，都呈先升后降的趋势.以往研究中，多数田间防病研究的防治效果均大于50%，防治效果明显.如林星辰等[18]采用病原菌与生防菌共同处理方式在大田进行人参病害防治试验，结果显示其对根腐病的相对防治效果为58.56%；朱涵明月[19]等利用蓝花楹内生拮抗菌田间防治蓝花楹茎腐病时，在轻度发病区防治效果达到了74.1%.由此可见，拮抗菌在田间病害防治具有较大的潜力.拮抗菌在大田对环境的营养、pH、含氧量及温度条件要重新适应，这需要一段时间，可能会影响到抗病原菌的能力.增强拮抗菌的适应性，不断摸索田间使用拮抗菌的条件，将是未来研究的主要方向.