结核分枝杆菌对贝达喹啉药物敏感性动态监测及耐药机制研究

王璐 薛仲探 王玉峰 尚媛媛 任卫聪 姚丛 高飞 逄宇

贝达喹啉(bedaquiline，Bdq)是近50年来首个具有全新作用机制的抗耐多药结核病(MDR-TB)的条件获批药物[1-2]。其作用机制是靶向抑制结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)5′-三磷酸腺苷酶合成酶，干扰MTB能量合成，从而发挥抗菌及杀菌作用。Bdq的药理活性位点由喹啉中心杂环核和叔醇、叔胺侧链基团组成，通过与膜结合的F1F0-ATP合酶c亚基结合而发挥抗结核作用[3]。本研究通过动态监测我国肺结核患者MTB临床分离株对Bdq的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果，了解耐药情况，并分析耐药相关基因，以为后续耐药机制研究提供资料。

材料和方法

一、菌株来源

MTB菌株分离自来自NDIP(New Drug Introduction Protection)项目合作医院的189例肺结核患者，其中，28例来自成都市公共卫生临床医疗中心，23例来自沈阳市胸科医院，19例来自长沙市中心医院，24例来自郑州市第六人民医院，23例来自首都医科大学附属北京胸科医院，49例来自武汉市肺科医院，23例来自黑龙江省传染病防治院；130例患者仅提供基线(服用Bdq第1剂前1周内)培养阳性菌株，59例除提供基线菌株外还提供开始含Bdq方案治疗后第2、4、8、12、16、20、24周时收集的培养阳性菌株。药敏试验阳性对照菌株(ATCC编号：27294)来自北京重大疾病临床数据和样本资源库(结核病库)。

二、主要试剂与仪器

商品化MTB冻干微孔板药敏试验试剂盒，为美国Thermo Fisher公司定制的CMP1BDQ 96孔药敏试验微孔板；药敏试验所用中性罗氏培养基购于珠海银科医学工程有限公司；药敏试验培养基所用7H9液体培养基粉及营养添加剂OADC均购自美国BD公司；菌株基因组DNA提取所用MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit试剂盒购自美国Lucigen公司；DH9-9272细菌培养箱购自上海一恒仪器有限公司。

三、研究方法

1.最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：Bdq的MIC范围为0.008～4 μg/ml，目前国际公认和推荐的体外药敏试验临界药物浓度为0.25 μg/ml[4]。菌株对Bdq的MIC没有变化是指Bdq治疗结束后分离菌株对Bdq的MIC与基线菌株对Bdq的MIC相比没有改变，或变化仅为一个浓度梯度(即提高1倍)；Bdq在治疗过程中敏感性降低定义为MIC值与基线相比升高不低于4倍，但MIC值尚未达到可以判断“耐药”的临界药物浓度；Bdq耐药定义为Bdq的MIC升高达到了临界药物浓度(0.25 μg/ml)。微孔板法判断MTB对各抗结核药品耐药的临界MIC值见表1。

表1 微孔板法药敏试验检测结核分枝杆菌对抗结核药品耐药的临界MIC值

2.药敏试验：应用含12种预制冻干药品的CMP1BDQ 96孔药敏板进行药敏试验。从固体培养基上刮取新鲜菌落，将试验用菌液比浊至0.5 麦氏单位后转移 100 μl至7H9/OADC肉汤培养基试管，得到 1×105CFU/ml(范围为 5×104～5×105CFU/ml)的接种液；将菌株接种于药敏板上，使用封口黏附膜药敏板，在35 ℃～37 ℃有氧环境下孵育7～14 d，检查其生长情况。如果14 d后生长情况不好，重新继续孵育药敏板至21 d。应用微孔板药敏分析仪 Vizion对药敏板进行拍照并保存影像资料。药敏试验板设置阴性对照孔及阳性对照孔。

3.PCR扩增及测序：根据药敏试验结果，筛选对Bdq耐药的MTB菌株及与耐药菌株相关联的来自同一患者的不同时期的菌株，运用试剂盒提取菌株DNA。配制50.0 μl反应体系：25 μl 2×MIX，18 μl ddH2O，正向、反向引物(10 μmol/L，引物序列见表2)各1.0 μl，DNA模板5.0 μl。扩增程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s 35个循环，52 ℃/58 ℃ 30 s 35个循环，72 ℃ 30 s 35个循环，4 ℃保存。制备1%质量浓度的琼脂糖凝胶，取5 μl的PCR产物进行电泳，验证目的条带大小。将扩增成功的剩余PCR产物送北京睿博兴科生物技术公司进行基因测序。运用BioEdit软件将测序成功的序列与在美国国家生物信息中心(NCBI)上查得的标准序列进行比对分析。

表2 结核分枝杆菌对贝达喹啉耐药基因扩增引物序列

四、统计学处理

采用SPSS 22.0软件，计数资料采用“率(%)”表示，组间差异的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者情况

189例患者中79例(41.8%)为广泛耐药结核病(XDR-TB)，57例(30.2%)为准广泛耐药结核病(Pre-XDR-TB)，15例(7.9%)为耐多药结核病(MDR-TB)，25例(13.2%)单耐异烟肼或利福平，13例(6.9%)为药物敏感。57例Pre-XDR-TB患者中，有53例(93.0%)对氟喹诺酮类药品(氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星)耐药，4例(7.0%)对阿米卡星、卡那霉素或卷曲霉素耐药。

二、基线MIC分布及Bdq原发耐药

1.基线菌株对Bdq的MIC：189例患者的基线MTB临床分离株对Bdq的MIC分布如图1所示。可以看出，Bdq对MTB具有较强的抑菌能力。86.2%(163/189)的基线菌株对Bdq的MIC值分布在0.06 μg/ml以下，MIC50和MIC90分别为0.03 μg/ml和0.12 μg/ml。

MIC：最小抑菌浓度

2.原发耐药：以0.25 μg/ml作为Bdq临界耐药浓度，4例(2.1%，4/189)患者显示原发对Bdq耐药，其中，包括1例单耐异烟肼患者和3例XDR-TB患者。进一步分析4株Bdq原发耐药菌株基线时对其他二线抗结核药品的MIC，发现其中3株菌株基线时同时对Cfz耐药，对氟喹诺酮类药品也普遍耐药，见表3。

表3 贝达喹啉原发耐药菌株基线时对二线抗结核药品的MIC分布(μg/ml)

三、Bdq治疗过程中MIC的变化及获得性耐药

将59例具有基线后续阳性培养菌株患者所提供的系列菌株MIC进行对比分析，发现51例(86.4%)在治疗期间对Bdq的MIC没有变化[即治疗结束时菌株对Bdq的MIC与基线MIC相比没有改变，或变化仅为一个浓度梯度(即提高1倍)]，8例(13.6%)观察到对Bdq敏感性降低。对Bdq敏感性降低患者中，5例的MIC升高达到了临界药物浓度(0.25 μg/ml)，包括1例在治疗24周时痰培养结果显示并发非结核分枝杆菌(NTM)感染，1例治疗过程中丢失随访，其余3例(1.6%，3/189)即为接受规范治疗后产生的获得性耐药。3例获得性耐药患者中，2例为XDR-TB、1例为Pre-XDR-TB。该3例在治疗24周时痰培养结果仍为阳性，判断为治疗失败。

四、Bdq与Cfz的交叉耐药情况

189例患者对Bdq的耐药率为2.1%(4/189)，明显低于对Cfz的耐药率(7.4%，14/189)，差异有统计学意义(Fisher精确概率法，P=0.006)。4例Bdq原发耐药患者中，3例已经存在Cfz耐药；14例Cfz耐药患者中，3例(21.4%)发生了Bdq耐药。3例Bdq获得性耐药的患者有2例同时存在Cfz耐药。

五、Bdq耐药基因突变分析

4例对Bdq原发耐药的患者MTB分离株均检测出Rv0678突变，未检出atpE、pepQ和Rv1979c突变。3例Bdq获得性耐药患者MTB分离株均检测出Rv0678突变，1株发生Rv1979c突变，未检出pepQ和atpE发生突变的菌株。7株发生Rv0678突变的菌株中，有1株没有在已经报道的Bdq耐药相关位点发现基因突变。对Bdq敏感性降低的患者分离的3株菌株中有2株检出Rv0678突变，1株检出Rv1979c突变，未检出atpE和pepQ突变菌株，且均发生在已经报道的Bdq耐药相关位点(表4)。

表4 贝达喹啉耐药或敏感性降低患者结核分枝杆菌分离株对贝达喹啉耐药相关基因突变情况

讨 论

Bdq是最近上市的具有特殊作用机制的抗结核新药，其出现耐药的情况备受关注。在患者治疗过程中系统监测Bdq耐药性十分必要[5-6]。由本研究结果也可以看出，在无Bdq治疗史的患者中，定期监测Bdq的耐药性尤为重要；同时，在使用Bdq进行规范治疗的患者中，也需要定期监测，以达到监测疗效的目的。本研究显示，我国结核病患者对Bdq的耐药目前处于较低水平，原发耐药率为2.1%，与南非(2.3%)、俄罗斯(1.3%)、法国(2%)的报道类似[7-8]；而在治疗过程中获得性耐药率约为1.6%，与南非、俄罗斯、蒙古等国及荟萃分析报道的获得性耐药率(2%～9%)比较，处于较低水平[6-7，9]。

本研究中4例Bdq原发耐药患者和3例Bdq获得性耐药患者没有发现可能影响治疗结果的线索。在4例Bdq原发耐药患者中，有1例为单耐异烟肼患者；而Bdq获得性耐药的3例患者中，2例为XDR-TB、1例为Pre-XDR-TB。因此，相对复杂的耐药背景可能是发生Bdq获得性耐药的原因之一。尽管本研究发现的Bdq原发性耐药和获得性耐药的患者数量有限，但也可以提示，比起原发耐药，发生Bdq获得性耐药的患者可能更容易发生治疗失败。

尽管MTB对Bdq耐药的产生机制尚并未完全明确，但目前已经了解的与Bdq耐药相关的基因包括atpE、Rv0678和pepQ[7]。其中，atpE是编码ATP合成酶的跨膜蛋白，是Bdq独特的药物作用靶点；而Rv0678则编码调控药物外排泵MmpS5/MmpL5系统的表达，该基因突变后会导致MmpS5/MmpL5外排泵的表达上调，从而降低了胞内的药物浓度，进而降低Bdq的疗效。pepQ通过阻止外排泵系统MmpS5/MmpL5蛋白的降解导致药物外排的增多和胞内药物浓度的降低[2，10-11]。关于MTB对Bdq与Cfz的交叉耐药，有研究发现，患者既往服用Cfz有可能导致Bdq耐药，因Bdq与Cfz具有相同的外排泵MmpS5/MmpL5系统，该外排泵的上调会导致耐药的发生[12-13]。因此，MTB的Rv0678突变被认为是与Bdq和Cfz交叉耐药相关[7]。Cfz目前被WHO推荐用于MDR-TB的治疗，列为B组次选药物的首位[14-15]。本研究中，对Bdq原发耐药的菌株中绝大部分已经存在Cfz耐药，提示我国患者对于Bdq的原发耐药可能是由于Bdq和Cfz的交叉耐药引起。此外，除上述3个普遍公认的与MTB对Bdq耐药相关的基因外，同样与外排泵表达相关的Rv1979c也被认为与MTB对Cfz耐药相关；也有报道认为其突变与MTB对Bdq低度耐药相关[16]。本研究所纳入患者分离的Bdq耐药菌株的Rv1979c突变均发生在已经报道的耐药相关位点；而发生Rv0678突变株中，有1株耐药菌在已经报道的耐药相关位点之外发生突变，提示MTB对Bdq的耐药可能存在其他机制，需进一步研究。

本研究存在一定的局限性。首先，由于本研究数据是针对临床患者分离菌株的实验室研究，未设置对照组，存在一定的患者选择偏倚。第二，本研究所进行的MIC检测及其他实验，均没有进行重复验证，可能存在系统误差。第三，世界卫生组织相关指南建议使用BACTEC MGIT 960检测MTB对Bdq的耐药，但本研究使用的是微孔板稀释法，方法学的差异可能造成检测结果存在偏差。