山东地区439株非结核分枝杆菌临床分离株菌种鉴定及耐药情况

封彬彬 金锋 景辉 王俊玲 林美英 乔秀丽 李铭 邱丽华

非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)在自然界中广泛分布，已知190余种[1]，人和动物均可感染，主要引起肺部病变等。我国NTM肺病的发生率呈明显上升趋势[2]，危害性日益凸显。NTM肺病的临床症状、影像学表现与肺结核相似，但治疗方案明显不同，极易误诊误治，迁延不愈[3]。为此，笔者回顾性分析山东地区NTM肺病患者临床分离株的菌种分布及耐药情况，为早期诊断及治疗NTM肺病提供依据。

材料和方法

1.菌株来源：收集2015年1月至2019年12月山东省胸科医院收治的经BACTEC MGIT 960培养阳性的疑似肺结核患者临床分离株，共计3783株，其中，439株鉴定为NTM，对可继续分型检测的354株NTM菌株进行菌种鉴定和耐药检测。354株NTM菌株分离自354例NTM肺病患者，其中，男230例(64.97%)，女124例(35.03%)；年龄范围为11～90岁，年龄中位数(四分位数)为60(50，66)岁；分离标本包括支气管毛刷物标本29份、肺泡灌洗液标本8份、痰液和(或)胸腔积液标本共计317份。

2.菌种鉴定：(1)初步菌种鉴定：按照《结核病实验室检验规程》[4]对BACTEC MGIT 960培养阳性菌株进行早期分泌蛋白(MPB64)抗原胶体金方法检测，阴性为NTM。(2)DNA微阵列芯片法菌种鉴定：严格按照说明书进行操作。以试剂盒自带的阴性和阳性对照作为质控，依次进行核酸提取、PCR扩增、芯片杂交、芯片洗涤和干燥、芯片扫描和结果判读。可检测临床常见的17种分枝杆菌，包括结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌等。(3)质谱菌种鉴定：采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)微生物鉴定系统对上述17种之外的分枝杆菌进行鉴定。

3.药物敏感性试验(简称“药敏试验”)：(1)罗氏培养基绝对浓度法(2018年前)。检测的10种药品及其浓度分别为：异烟肼：1、10 μg/ml，利福平：50、250 μg/ml，乙胺丁醇：5、50 μg/ml，链霉素：10、100 μg/ml，氧氟沙星：25、100 μg/ml，左氧氟沙星：1、10 μg/ml，卷曲霉素：10、100 μg/ml，卡那霉素：10、100 μg/ml，阿米卡星：10、100 μg/ml，对氨基水扬酸：1、10 μg/ml。当含药培养基上生长的菌落数≥20个即判定为耐药(包括高浓度耐药和低浓度耐药)。(2)液基微孔板法(2018年及以后)。对选取的NTM菌株进行15种药品的药敏试验，应用细菌超声分散计数仪进行细菌的超声比浊定量，按照药敏检测试剂盒(微孔板法)说明书进行操作判读。不同药品及最低抑菌浓度(MIC)分别为：利奈唑胺≥32 μg/ml；克拉霉素≥16 μg/ml；利福平≥6 μg/ml；阿米卡星≥64 μg/ml；亚胺培南≥16 μg/ml；乙胺丁醇≥5 μg/ml；头孢西丁≥80 μg/ml；阿奇霉素≥16 μg/ml；利福布汀≥2 μg/ml；妥布霉素≥6 μg/ml；加替沙星≥1 μg/ml；莫西沙星≥8 μg/ml；多西环素≥8 μg/ml；米诺环素≥8 μg/ml；复方磺胺甲噁唑≥80 μg/ml。

4.统计学处理：采用Excel 2016和SPSS 19.0软件对数据进行整理和统计学分析。计数资料采用“构成比或百分率(%)”表示，组间差异的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.菌种鉴定：354株NTM菌株共鉴定出12种菌种，主要以胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌及脓肿分枝杆菌为主(表1)。

表1 2015—2019年山东地区354株非结核分枝杆菌临床分离株的菌种分布

2.各患者年龄及性别分布：NTM临床分离株各菌种在不同性别及年龄患者中分布差异均有统计学意义，其中，胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌以男性感染为主，脓肿分枝杆菌以女性感染为主；中老年(≥45岁)感染者占84.75%(300/354)，见表2。

表2 不同性别和年龄非结核分枝杆菌肺病患者感染菌种的分布情况

3.药敏试验结果：354株NTM菌株中有183株行药敏试验，其中，50株采用绝对浓度法检测，结果显示：除对乙胺丁醇的耐药率为52.00%外，对其余9种药品的耐药率均高于86.00%(表3)。133株采用微孔板法进行药敏试验，结果显示：不同NTM菌种对阿米卡星及克拉霉素的耐药率均低于10.00%，而对莫西沙星均敏感；对亚胺培南/西司他丁、多西环素、米诺环素、复方磺胺甲噁唑的耐药率均较高。同时对利奈唑胺、利福平、乙胺丁醇、头孢西丁等9种药品的耐药率存在种间差异(表4)。

表3 采用绝对浓度法检测不同药品对50株不同菌种NTM菌株的耐药情况

表4 采用微孔板法药敏试验检测不同药品对133株不同菌种NTM菌株的耐药情况

讨 论

随着人口老龄化、免疫抑制人群的增多，以及长期服用抗生素可能为NTM提供了良好的生长繁殖环境[5]；加之实验室检测水平的提高，NTM的发病率和患病率在一些国家和地区呈上升趋势，甚至超过了结核病[6]。NTM菌种丰富，治疗方案也各不相同，且大部分对抗结核药物具有天然耐药性，临床诊断治疗面临极大困难。因此，了解本地区NTM菌种分布和及早进行药敏试验对NTM肺病的正确诊断及有效治疗意义重大。

NTM菌种分布具有明显的地域差异，如全球范围和呼吸道的NTM分离株中鸟分枝杆菌复合群的分离率最高，也是临床相关性最强的菌种[7-8]。但我国的NTM主要以胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌为主，且分别是东部和南部地区的主要致病菌株[9]。本次调查共检出12种NTM菌种，胞内分枝杆菌的占比最高(69.77%)，与对中国东部(68.33%)的研究基本一致[10]，但高于北京地区(39.2%)[11]；其次是堪萨斯分枝杆菌(12.71%)，明显低于北京地区(37.7%)[11]和上海地区(45.0%)[12]；而鸟分枝杆菌复合群的检出率很低，仅为1.41%。可能与地域性差异、临床分离株数量少或相关调查时间差距较大有关。

既往研究发现，年龄和性别是NTM致病的主要危险因素，NTM的发病率随年龄的增高而逐步上升[11,13-14]，而与结核病、糖尿病及慢性阻塞性肺疾病等无关[15]。本研究中，男性患者多于女性，45岁及以上患者达84.75%，与华东地区[16]和北京地区[11]的报道情况基本一致。这可能与男性吸烟较多易诱发呼吸道疾病，以及中老年人群免疫力降低，或既往感染后定植于呼吸道而未发病有关[17]。但也有研究认为，NTM肺病是慢性病，可发生于任何年龄，且女性患病率明显高于男性，尤其是绝经期妇女较为常见[5-6,18]，仅与本研究中脓肿分枝杆菌的性别分布结果一致。笔者认为与所处地区、纳入患者种类及数量大小有关。

NTM的细胞壁具有高疏水性和透过率，药物不易蓄积，致药物作用浓度较低，极易产生耐药或耐多药[11,19]。本研究采用绝对浓度法对50株NTM行10种抗结核药品的耐药性检测，发现除对乙胺丁醇的耐药率偏低(52.00%)外，对其他9种药品的耐药率均≥86.00%，与沈瑶杰等[20]报道的“大多数NTM对传统抗结核药物的活性均很低或没有”的结论基本一致。考虑与其能阻碍NTM细胞壁的合成有关[21]。但本次调查发现，NTM对阿米卡星的耐药率(96.00%)相对较高，不同于其他研究显示的阿米卡星对鸟分枝杆菌和龟-脓肿分枝杆菌等有较强的抗菌活性结论[22-23]，也与《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南(2020年版)》[21]中指出的多数NTM菌株对阿米卡星敏感。阿米卡星是治疗NTM肺病常用且有效药品的理论相悖，考虑可能与该药近年来在临床中已被广泛应用有关，应对患者的用药进行跟踪随访。绝对浓度法检测结果的高耐药性说明对NTM仅进行一、二线抗结核药物的耐药性分析不能很好地指导临床用药，应积极进行其他药物的耐药性检测。

微孔板法药敏试验是近年来发展出来的新技术，可以同时获得较为详细的多种抗生素的耐药数据和简明的耐药值及MIC值的判断，具有较高的符合率及特异度。笔者所在医院于2018年开始采用NTM微孔板药敏试验检测试剂盒(含15种药品)，本次调查中133株NTM菌株采用此法检测，结果发现菌株总体对莫西沙星、阿米卡星和克拉霉素的敏感性较高，且对不同NTM菌种的体外活性均表现较强，与既往的研究结果一致[24-25]，并有长期口服莫西沙星治愈脓肿分枝杆菌肺病患者的病例报道[26]。可能与药品进入菌体的方式、脂溶性的大小、菌体表面有无外排泵等性质有关，也可能与莫西沙星不经细胞色素P450酶代谢，减少了药物间相互作用的可能性，在与其他抗生素联合使用时降低了耐药的发生率有关。因此，笔者认为莫西沙星口服方便，吸收利用度高，患者依从性好，当没有药敏试验结果时，莫西沙星、阿米卡星和克拉霉素可以作为临床治疗NTM肺病的优选抗生素，即使体外药敏试验为耐药，也应与克拉霉素或其他抗生素联合使用，对临床治疗是一种较好的选择[27]。另一方面，不同NTM菌种的耐药种类和耐药率也不同。本研究显示，胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌对利奈唑胺、利福平、乙胺丁醇、头孢西丁等药品的耐药率的差异均有统计学意义。因此，建议临床用药前应尽量进行菌种鉴定和药敏试验以指导科学用药。