抑制脑信号蛋白3A对糖尿病肾病大鼠的影响及作用机制研究

帅欢 唐继军 凌利平

糖尿病肾病是糖尿病中常见的一种微血管并发症，且常伴随炎症状态。严重时可直接导致肾功能不全，是导致患者残疾和死亡的重要因素之一[1]。因此早期的预防和治疗是减少和避免糖尿病肾病发生的关键。有研究表明，脑信号蛋白3A的表达能够作为诊断糖尿病肾病的发生及蛋白尿严重程度的重要指标[2]。脑信号蛋白3A是能够通过调节神经生长导向轴突生长方向，随着更多的研究证明，其还能够参与细胞的迁移、肿瘤生长和免疫反应等多种生物学功能[3]。但目前笔者所见临床上对脑信号蛋白3A于糖尿病肾病影响机制研究较少，因此在本文研究中为寻找治疗糖尿病肾病的方向，建立糖尿病肾病模型大鼠，通过抑制脑信号蛋白3A的表达，观察下调脑信号蛋白3A对糖尿病肾病大鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究动物：选取SPF级40只SD健康大鼠(北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK20060009)，由基尔顿生物科技(上海)有限公司提供，鼠龄(3.5±0.2)个月，体重(219.7±8.5)g。大鼠均养殖在干净笼子里，室温(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮纯净水，饲养时间1周。本实验均获得医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂：大鼠抗小鼠TGF-β1抗体(上海一基实业有限公司)；小鼠抗大鼠α-SMA抗体(沈阳万类生物科技有限公司)；兔抗大鼠骨形成蛋的(BMP7)抗体、E-Cadherin抗体(武汉菲恩生物科技有限公司)；兔抗小鼠Smad6抗体(上海恒斐生物科技有限公司)；24 h尿微蛋白 ELISA试剂盒(南京卡米洛生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组、建模及给药:随机选取40只大鼠中10只作为正常组，剩余大鼠参照陈卫东等[4]研究实验中糖尿病肾病模型大鼠建立方法建立模型，30只大鼠均通过高糖高脂饲料喂养4周后，进行腹腔注射，一次性注射55 mg/kg的链脲佐菌素，正常组给予普通饲料喂养，腹腔注射枸椽酸盐缓冲液，72 h后使用血糖仪测定血糖，血糖≥16.7 mmol/L，则表示糖尿病模型建造成功，24 h尿量大于造模前50%且24 h尿蛋白排泄率>30 mg/24 h，表示糖尿病肾病模型制备成功。将建模成功的30只糖尿病肾病模型大鼠随机分为模型组、上调组、下调组，每组10只。

1.2.2 细胞转染:取大鼠过上调组、下调组大鼠肾脏组织细胞，在培养瓶中进行融合，融合率在75%时，行胰酶消化，之后使用细胞计数法对消化后的细胞密度进行测量，然后将细胞植于六孔板中，大约种植4×105个细胞，加入新鲜培养基，进行培养，并在5%CO2、37℃的培养箱中孵育，当融合率在40%～80%时，取1.5 μl DNA溶于100 μl双抗培养基中，进行混合，混合后进行离心处理，并在EP管中加入12 μl的PolyFect Reagent，上下颠倒5次，混匀处理，之后进行静置5～10 min，对转染复合物起到促进作用，并吸去六孔板加入，在含有转染复合体的EP管中加入含有血清和双抗的600 μl完全培养基，颠倒2次，进行摇晃，促进复合物的均匀分布，然后之后进行培养24 h后换液处理，倒置，使用荧光显微镜下对荧光亮度进行观察，然后进行收集，提取RNA，将转染效率最高的质粒组、空载组稀释液接种于10 mm2培养皿中，使用40 μl 嘌呤霉素至每孔常规培养，培养3天后弃去培养液,选取PCR验证筛选的细胞消化处理并稀释，稀释后置于24孔板中，建立稳定转染的脑信号蛋白3A上调组(上调组)、脑信号蛋白3A下调组(下调组)。

1.2.3 切片及染色：取大鼠肾脏组织，在4%多聚甲醛进行固定、脱水透明，浸蜡包埋，脱蜡、HE染色，之后脱水、透明，待封片晾干后在显微镜下观察大鼠肾脏组织病理学表现。

1.2.4 BUN、Scr、UA、血糖、糖化血红蛋白、24 h尿微蛋白、血脂水平检测：采用Olympus AU640全自动生化测定仪对尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿酸(UA)、血糖、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平进行检测；采用TOSOH公司生产的G7糖化血红蛋白分析仪对糖化血红蛋白进行检测；采用放射免疫法对24 h尿微蛋白水平进行检测。

1.2.5 GSH-Px、GSH、CAT水平检测:采用DNTB比色法对超氧化物歧化酶(GSH-Px)活性进行检测；采用Beutler改良法对谷胱甘肽(GSH)含量进行检测；采用容量法对过氧化氢酶(CAT)活性进行检测。

1.2.6 肾小球结构指标检测:采用ImageJ1.40图像分析软件对肾小球基底膜厚度、足突宽度进行测量。

1.2.7 TGF-β1/Smad6/BMP7通路蛋白检测：使用蛋白免疫印迹(Western blot)对TGF-β1/Smad6/BMP7中TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin通路蛋白进行检测，提取大鼠肺组织中的样品总蛋白，将其与上样缓冲液按比例混合，煮沸5 min后，进行电泳，并将蛋白电转至PVDF膜，使用5%的脱脂奶粉封闭1～2 h，然后加入一抗溶液TBST(TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin按照1∶1 000稀释)，在4℃条件下进行震荡过夜，再次洗涤，放入二抗溶液TBST(TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin按照1∶5 000稀释)，室内震荡120 min后，洗涤，显色成像，使用软件分析蛋白条带灰度值。内参蛋白是GAPDH。

2 结果

2.1 肾脏组织病理学观察 正常组大鼠肾小管间质结构正常；模型组肾小球肥大，重度系膜细胞增生，肾间质炎性细胞浸润；上调组肾小球严重肥大，伴随重度增生和大量炎性细胞浸润；下调组大鼠少量胶原纤维化，间质轻度纤维化，少量炎性细胞浸润。见图1。

正常组 模型组 上调组 下调组

2.2 4组大鼠BUN、Scr、UA水平比较 模型组、上调组、下调组大鼠BUN、Scr、UA水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；上调组大鼠BUN、Scr、UA水平高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调组大鼠BUN、Scr、UA水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调组大鼠BUN、Scr、UA水平低于上调组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠BUN、Scr、UA水平比较

2.3 4组大鼠血糖、糖化血红蛋白、24 h尿微蛋白比较 模型组、上调组、下调组大鼠血糖、糖化血红蛋白、24 h尿微蛋白高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；上调组、大鼠血糖、糖化血红蛋白、24 h尿微蛋白高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调组大鼠血糖、糖化血红蛋白、24 h尿微蛋白低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调组大鼠血糖、糖化血红蛋白、24 h尿微蛋白低于上调组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠血糖、糖化血红蛋白、24 h尿微蛋白比较

2.4 4组大鼠血脂水平比较 模型组、上调组、下调组大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；上调组、大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调组大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调组大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平低于上调组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠血脂水平比较

2.5 4组大鼠氧化抗氧化酶水平比较 模型组、上调组、下调组大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；上调组大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调组大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调组大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平高于上调组(P<0.05)。见表4。

表4 4组大鼠氧化抗氧化酶水平比较

2.6 4组大鼠肾小球结构指标比较 模型组、上调组、下调组大鼠肾小球基底膜厚度、足突宽度高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；上调组大鼠肾小球基底膜厚度、足突宽度高于模型组(P<0.05)；下调组大鼠肾小球基底膜厚度、足突宽度低于模型组(P<0.05)；下调组大鼠肾小球基底膜厚度、足突宽度低于上调组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 4组大鼠肾小球结构指标比较

2.7 4组大鼠肾组织TGF-β1/Smad6/BMP7信号通路蛋白表达量比较 模型组、上调组、下调组大鼠肾组织中TGF-β1、α-SMA蛋白表达量高于正常组，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表达量低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；上调组大鼠肾组织中TGF-β1、α-SMA蛋白表达量高于模型组，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表达量低于模型组，具有统计学差异(P<0.05)；下调组大鼠肾组织中TGF-β1、α-SMA蛋白表达量低于模型组，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表达量高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调组大鼠肾组织中TGF-β1、α-SMA蛋白表达量低于上调组，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表达量高于上调组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6，图2。

表6 4组大鼠肾组织TGF-β1/Smad6/BMP7信号通路蛋白表达量比较

图2 肾组织中TGF-β1/Smad6/BMP7通路蛋白Western blot图

3 讨论

糖尿病肾病是指糖尿病微血管病变最终导致肾小球硬化一种疾病，又称为糖尿病肾小球综合征。高血糖是引起肾脏微血管病变的主要原因之一，而高血压和高血脂是导致疾病加重的重要因素[5,6]。张馨元等[7]研究表明，足细胞的表观遗传修饰、氧化应激、糖代谢异常、血流动力学改变、炎性细胞因子、胰岛素抵抗等损伤机制及相关蛋白的影响作用，对糖尿病肾病的调控机制及疾病进展具有重要意义。

脑信号蛋白3A是由多个不同功能的亚群组成，其所有成员均有一个高度保守的氨基酸序列，由500多个氨基酸组成，被称为Sema结构域[8]。其结构域是脑信号蛋白发挥作用的重要结构。有研究表明，脑信号蛋白3A是抑制神经轴突延伸发展的重要结构，且包含这多种氨基酸序列[9]。糖尿病是糖尿病肾病重要的并发症之一，目前，其发病率仅次于肾小球炎，呈逐年上升趋势。本研究发现，下调组大鼠BUN、Scr、UA水平低于上调组，此结果说明，抑制脑信号蛋白3A的表达，能够降低对肾组织中BUN、Scr、UA水平，且减少对肾组织的损伤。有研究表明，脑信号蛋白3A在足突细胞及集合管内皮细胞中均呈现出高表达[10]。脑信号蛋白3A的过度表达可直接导致肾小球内皮细胞损伤，并对肾小球基膜也会造成一定的损害。脑信号蛋白3A在正常机体内并不表达，在尿链佐菌素至糖尿病肾病大鼠模型中，随着时间的增加其表达显著升高。孙艺欣[11]等研究表明，Sema 3A与早期肾损伤的发生密切相关，可作为CIAKI的早期生物标志物。因此在本文中通过抑制脑信号蛋白3A表达，观察对糖尿病肾病大鼠的影响，结果显示，抑制脑信号蛋白3A能够降低对肾组织的损伤，效果显著。

糖尿病的发生会对肾脏产生严重的损伤，时肾小球体积增大，系膜细胞发生增生、肥大等情况，部分肾小管组织出现空泡变性，出现细胞凋亡情况。糖尿病肾病的发生会对血糖、血脂水平造成严重的影响。有研究表明，血糖波动幅度过大会加剧DN患者机体炎症状态，损害患者肝肾功能[12]。本研究发现，下调组大鼠血糖、糖化血红蛋白、24 h尿微蛋白、血脂水平均低于上调组，此结果说明，抑制脑信号蛋白3A，能够降低血糖、糖化血红蛋白、24 h尿微蛋白、血脂表达水平，降低肾组织损伤程度。与张莉等[13]研究结果一致。糖尿病肾病蛋白尿的发生是一个复杂的病理过程，其关系到肾小球的过滤状态、足细胞凋亡、肾小管损伤等。在本文研究中发现，下调组大鼠氧化抗氧化酶水平高于上调组，且肾小球基底膜厚度、足突宽度低于上调组，由此可得，抑制脑信号蛋白3A能够提高氧化抗氧化酶水平，且减少对肾小管结构指标的损伤。廖正[14]的研究表明，Sema3A过表达可诱导肾足细胞足突消失或发育延迟，抑制输尿管芽分支和肾小球血管正常形成，导致肾小球发育不良和蛋白尿。与本文研究结果保持一致。

肾小管上皮细胞间质化，在一定条件下其过程是可逆的。TGF-β1/Smad6/BMP7信号通路能够参与细胞间质化的过程，TGF-β1具有促进细胞外基质的合成和沉积，进而诱导细胞的凋亡，参与炎症的发生，能够在多个方面加快糖尿病肾病的病程进展[15]。Smads蛋白家族是TGF-β1受体激酶的底物，也是其通路中重要的信号传导分子[16]。BMP7能够通过抑制肾小管上皮细胞胶原和α-SMA的表达，逆转细胞间质。Smad6和BMP7在糖尿病肾病肾纤维化的进展中发挥着重要做用，是保护肾脏组织的重要因子[17]。α-SMA是一种肌纤细胞蛋白，其主要寄存与正常肾血管的平滑及细胞中，若其他其细胞中表达，则说明上皮间质发生病变[18,19]。e-cadherin是属于跨膜蛋白，也是钙粘附蛋白E，是一种钙依赖性的跨膜蛋白，且能够参与细胞与细胞之间的黏附，其主要分布于人和动物的上皮细胞，能够维持细胞的极性和完整性[20]。因此本研究中对TGF-β1/Smad6/BMP7通路蛋白表达量进行检测，结果显示，下调组大鼠肾组织中TGF-β1、BMP7、α-SMA蛋白表达量低于上调组，且Smad6、E-Cadherin蛋白表达量高于下调组，此结果说明，抑制脑信号蛋白3A可有效改善大鼠肾组织TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin蛋白表达量，减少肾损伤。

综上所述，抑制脑信号蛋白3A能够减少肾小球内皮细胞和足突细胞的损伤，降低对肾小球基膜的损害，其作用机制可能与调控TGF-β1/Smad6/BMP7信号通路有关。