miRNA-22在心肌肥厚大鼠中的表达及对PTEN、SERCA的调控作用

邓丹

研究心肌肥厚的病理机制，一直都是心血管疾病研究的重点。据报道，心肌肥厚受多种信号通路调节，包括钙调神经磷酸酶/细胞核因子、转化生长因子、肌浆网钙泵(Sarcoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase，SERCA)、磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog)、钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)等，而这些信号通路的促进或抑制作用与微小RNA(microRNA，miRNA)有关[1]。miRNA是一种内源性非编码的单链小RNA，转录后对基因表达具有负性调节的作用。文献显示，miRNA在心肌细胞生理病理过程中扮演着重要角色[2]。微小RNA-22(microRNA-22,miRNA-22)是miRNA家族中的一员，可通过调控靶基因c-Myc、MYCBP信号通路发挥抑癌作用[3]，能够增强食管癌细胞放疗的敏感性[4]，在癌症中研究较多。研究显示，miRNA-22与心肌肥厚有关[5]。凌琳等[6]研究发现，高表达的miRNA-22能够改善心脏运动能力和收缩功能，抑制心肌细胞纤维化。Xu等[7]研究认为，miRNA-22促进心肌肥大可能与PTEN基因通路有关。Gurha等[8]研究发现敲除miRNA-22的小鼠SERCA活性降低。基于此，本研究采用腹主动脉缩窄术制备心肌肥厚大鼠模型，观察降低或增加miRNA-22表达对PTEN、SERCA及心肌肥厚相关信号通路蛋白的调控作用，以期为阐明心肌肥厚发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 心肌肥厚大鼠模型的构建 60只雄性Sprague-Dawley大鼠(SPF级)，体重180～210(194.5±2.3)g，4～6(5.1±0.2)周龄，随机分为2组，观察组50只，对照组10只，采用腹主动脉缩窄术构建心肌肥厚大鼠模型。观察组采用10%的水合氯醛腹腔麻醉，无菌分离肾动脉和腹主动脉，于肾动脉上方约1 cm处，采用5.0型无菌尼龙缝合线将肾动脉与注射针管(外径0.7 mm)结扎，迅速移除针管。术后每天注射5 U青霉素，持续5 d。对照组处理同观察组，不做丝线结扎。

1.2 心肌肥厚指标测定

1.2.1 术后7周，采用彩色多普勒超声诊断仪测定左心室收缩末期左心室内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVDd)、左心室后壁舒张末期厚度(LVPWTd)和隔舒张末期厚度(IVSTd)。

1.2.2 观察组50只大鼠随机分为3组，A组20只，用于miRNA-22转染；B组20只，用于mi-RNA-22基因敲除；C组10只，用于心肌肥厚大鼠的表征及mi-RNA-22、SERCA、PTEN的测定。

1.2.3 处死C组和对照组大鼠，快速取出心脏，预冷的0.9%氯化钠溶液冲洗，剪掉心脏周围的组织，滤纸吸干，分离游离臂和室间隔，将左心室称重，然后见成小块，每只取2块采用10%甲醛浸泡，用于组织学检查；剩余置于冻存管中，液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存。

1.3 HE染色 将甲醛浸泡48 h的组织样品，采用乙醇脱水，石蜡包埋，旋切机切片后，进行标准的HE染色。然后在显微镜下观察两组的组织病理学表现。

1.4 miRNA-22、PTEN、SERCA表达测定 取冷冻的心肌组织，Trizol法提取总RNA，检测浓度和纯度。Taqman探针法测定miRNA-22，引物设计和合成由Invitrogen公司进行：逆转录反应体系：Taqman探针(10 μmol /L)0.10 μl、rTaq DNA 聚合酶(5 000 kU/L) 0.25 μl、2×Real-time PCR Mix 10 μl、Primer Set(20 μmol/L) 0.40 μl，RNase-free去离子水7.30 μl，逆转录产物2.00 μl，总共20 μl。反应条件：90℃/3 min，95℃/12 s，62℃/40 s，共40个循环。采用实时荧光定量PCR法测定miRNA-22的Ct值，miRNA-22的相对表达量以2-△Ct(miRNA-22-内参)表示。

1.4.1 逆转录/聚合酶链式反应(RT-PCR法)测定PTEN水平：逆转录反应体系：引物各10 pmol/L，KCl 50 mmol/L，pH8.4的Tris-HCl 10 mmol/L， sangon Taq DNA聚合酶2.5U， MgCl22 mmol/L，Dntp 0.2 mmol/L，共50 μl。反应条件：93℃/3 min后进入循环， 94℃/45 s，58℃/30 s，72℃/30 s，共35个循环。采用PTC-100热循环仪扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离。采用分析软件ScanImage测定条带密度，采用条带密度比值(PTEN/NADPH)表示PTEN的相对含量。

1.4.2 逆转录/聚合酶链式反应(RT-PCR法)测定SERCA水平。3’；SERCA：上游引物5’-TGAATAAACCGCCTCGG-3’，上游引物5’-CAGCACCATCAG CCACT-3’。严格按照试剂盒说明书操作。cDNA合成37℃/30min，预变性94℃/2min，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环。最后72℃延伸5 min。采用PTC-100热循环仪扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离。采用分析软件ScanImage测定条带密度，采用条带密度比值(SERCA/NADPH)表示SERCA的相对含量。

1.5 miRNA-22转染 A组20只大鼠，心肌肥厚模型构建成功后，在心肌肥厚区域均匀分5点，注射表达microRNA-22 腺病毒/空载体腺病毒(adeno-miR-22/adeno-null，由Invitrogen公司构建并证实转染效率)，病毒量约为0.1 ml(2×1012viral particles/L)。病毒转染后常规饲养4周。处死，取心脏组织测定miRNA-22、PTEN、SERCA表达情况。

1.6 基因敲除 B组20只大鼠，心肌肥厚模型构建成功后，进行miRNA-22基因敲除，然后常规饲养4周。处死，取心脏组织测定miRNA-22、PTEN、SERCA表达情况。

1.7 Western blot检测心肌CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表达 取A组、B组和C组冷冻的心肌组织，采用western blot测定CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表达水平。

2 结果

2.1 心肌肥厚大鼠组织学表现 显微镜下可见观察组心肌细胞直径增大。见图1。

图1 2组造模后大鼠心肌细胞HE染色图(×400)；A 对照组；B 观察组

2.2 观察组与对照组心肌指标比价 C组全心质量、左心室质量、LVDd、IVSTd、LVESD、LVPWTd高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明心肌肥厚大鼠造模成功。见表1。

表1 2组大鼠心肌指标比较

2.3 2组大鼠miRNA-22、PTEN、SERCA表达比较 C组miRNA-22表达高于对照组，PTEN、SERCA表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组大鼠miRNA-22、PTEN、SERCA表达比较

2.4 上调miRNA-22对心肌肥厚大鼠PTEN、SERCA表达的影响 A组miRNA-22表达高于C组(P<0.05)，miRNA-22表达显著上调。A组PTEN、SERCA低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组大鼠miRNA-22、PTEN、SERCA表达比较

2.5 下调miRNA-22对心肌肥厚大鼠PTEN、SERCA表达的影响 B组miRNA-22表达低于C组(P<0.05)，miRNA-22表达显著下调。B组PTEN、SERCA高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组大鼠miRNA-22、PTEN、SERCA表达比较

2.6 miRNA-22表达变化对CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表达的影响 3组大鼠心肌细胞CaN、ANP、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)，组间两两比较显示，CaN、CaMKⅡ比较A组>C组>B组； SERCA2a比较A组

表5 3组大鼠CaN、ANP、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白表达水平比较

3 讨论

心肌肥厚是心血管疾病的独立危险因素，也是心功能衰竭的病理基础。抑制心肌肥厚有助于心血管疾病的疾病的防治，降低发病率和死亡率[9]。研究显示，miRNA在心肌肥厚中扮演着重要角色[10]。庞志宇等[11]研究发现，共16种miRNA在心肌肥厚大鼠心肌组织中异常表达，其中包含miRNA-22。动物实验显示，miRNA-22心脏过表达是引起心肌肥厚的重要原因[12]，但相关机制研究报道较少。

miRNA-22在卵巢癌、食管鳞状细胞癌、肺癌中特异性表达，广泛参与癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程[13]。吴德佩[14]发现miRNA-22靶向PTEN/AKT/mTOR信号通路调控自噬及糖尿病肾病肾间质纤维化。随着研究的深入，人们发现miRNA-22与心脏疾病有关，在主动脉弓缩窄压力负荷模型中，microRNA-22(-/-)小鼠心脏扩张加剧、收缩功能失代偿严重，同时伴有心肌纤维化。凌琳等[6]认为心肌梗死后高表达的miRNA-22能够改善心肌结构和运动能力，减轻心肌纤维化。本研究采用腹主动脉狭窄术制备压力超负荷心肌肥厚动物模型心肌miRNA-22高表达，与前人[15]研究结果一致。生物学信息显示，miRNA-22通过结合T管生物起源关键蛋白的基因3’UTR的保守集合序列影响T管的发育，且葛根素会影响miRNA-22的表达，具体机制尚不明确。因此，miRNA-22在心肌肥厚大鼠中高表达的原因有待于进一步研究。

CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白是心肌肥厚发病中的关键因子，其水平的高低显著影响心肌肥厚的疾病进展。本研究观察发现，miRNA-22(+/-)显著影响CaN、SERCA2a、CaMKⅡ蛋白的表达，miRNA-22表达上调的心肌细胞CaN、CaMKⅡ表达上调，SERCA2a表达下调，反之亦然。钙/钙调蛋白激酶/钙调神经磷酸酶(Ca/CaMK/CaN)途径是调控心肌肥厚发病的重要信号通路之一，CaN、CaMKⅡ是该信号通路中的重要蛋白。在该信号通路调控中，随着钙离子内流导致细胞内钙离子浓度升高，从而激活钙调蛋白激酶II(CaMKⅡ)、CaN，导致CaN 、CaMKⅡ活性和表达量增加，促进心肌肥大[16]。SERCA2a则是一种大分子跨膜蛋白，在心肌肥大时发挥维持胞浆钙稳态的作用。已有研究[17]显示，SERCA2a 在终末期心力衰竭患者心脏中表达下调，且与心脏收缩和舒张功能有关。研究显示，心力衰竭、心肌肥大者SERCA2a在mRNA和蛋白水平方面均下调，导致胞浆对钙离子的吸收和摄取减慢，进而影响心肌舒张和收缩能力，并通过激活钙相关通路，促进心肌肥大[18]。

miRNA-22是具有调控作用点作用的非编码RNA，本研究结果显示miRNA-22心脏过表达会引起心肌肥厚，具体机制不明。李国然等[19]采用TargetScan等工具预测，SIRT1、PTEN、NAT5、HDAC4 和SRF可能是miRNA-22调控心肌肥厚的潜在靶基因。亦有研究指出，miRNA-22可通过影响SR钙操纵蛋白参与心肌肥厚进展[20]。本研究观察miRNA-22(+/-)对PTEN、SERCA基因通路的影响，结果显示，心肌肥厚大鼠miRNA-22表达上调，PTENmRNA、SERCAmRNA表达下调，呈负性关系。继续上调心肌肥厚大鼠miRNA-22表达，PTENmRNA、SERCAmRNA表达持续下调，反之PTENmRNA、SERCAmRNA表达增加，提示miRNA-22与PTEN、SERCA基因之间呈负性调节的关系。细胞试验显示，下调miRNA-22表达可通过抑制PTEN、SERCA信号通路而抑制心肌肥大[21,22]。PTEN为磷酸酶，在能够拮抗PI3K，催化PIP3脱磷酸，下调PIP3水平，从而逆转PI3K对PKB/AKT磷酸化，维持胞浆钙稳定。当miRNA-22表达上调，通过特异性作用于靶基因PTEN，PTEN表达下降，PI3K对PKB/AKT磷酸化作用增强，钙离子内流，胞浆钙浓度升高，Ca/CaMK/CaN信号通路激活，因而CaN、CaMKⅡ蛋白表达上调。SERCA是影响钙离子内流的另一信号通路，Gurha等[8]发现基因敲除小鼠SERCA活性及表达量降低，SR钙储存量减少。分析认为，miRNA-22上调抑制富嘌呤元素相关蛋白PURB的表达，使得抑制状态的SRF持续抑制，SRF与SERCA结合减少，导致SERCA基因及SERCA2a蛋白的表达降低。随着SERCA表达的持续减少，胞浆钙增多，相应 CaN、CaMKⅡ蛋白表达上调。

综上所述，miRNA-22在心肌肥厚中高表达，上调miRNA-22能够增加心肌细胞CaN、CaMKⅡ蛋白表达、降低SERCA2a表达，从而促进心肌肥厚，可能与抑制PTEN、SERCA基因通路有关。