茵栀黄汤HPLC指纹图谱及单煎与共煎化学成分研究*

河北中医学院 河北省中药配方颗粒技术创新中心 河北省中药材品质评价与标准化工程研究中心

麻景梅 李葆林 王迎春 甄亚钦 任艳青 牛丽颖 (石家庄 050091)

提要 目的：建立中药茵栀黄汤的HPLC指纹图谱，并对单煎与共煎化学成分进行对比分析，阐明单煎与共煎的差别。方法：色谱柱Agilent Eclipse plus-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，流量1.0 mL/min，柱温30 ℃，通过采集12批茵栀黄汤HPLC 指纹图谱，建立指纹图谱共有模式；对3批单煎混合液与共煎液指纹图谱的相似度、峰面积进行分析，阐明两者化学成分是否存在差异。结果：建立茵栀黄汤HPLC对照图谱，标定27个共有峰，指认12个色谱峰，分别为4-新绿原酸、6-绿原酸、8-隐绿原酸、10-栀子苷、13-芦丁、15-异绿原酸B、16-异绿原酸A、18-异绿原酸C、20-黄芩苷、25-千层纸素A苷、26-汉黄芩苷、27-黄芩素；3批单煎与共煎指纹图谱相似度在0.960以上。结论：建立茵栀黄汤指纹图谱，为其质控提供有效的方法；单煎与共煎化学成分组成一致，但峰面积有一定的差别。

茵栀黄汤由经方茵陈蒿汤(《伤寒论》)演变而成，由茵陈、栀子、黄芩、金银花组成，具有清热解毒，利湿退黄的功效，用于治疗湿热毒邪内蕴所致的黄疸、急慢性肝炎[1-2]。茵栀黄汤主要含黄酮类、环烯醚萜类、有机酸类等化学成分[3]，目前相关研究主要集中在茵栀黄口服液等中成药[4-7]，而对传统汤剂化学成分报道较少。

本实验利用高效液相色谱技术，对茵栀黄传统汤剂进行研究，建立茵栀黄汤指纹图谱分析方法及对照图谱，并对单煎与共煎HPLC 指纹图谱进行对比分析，考察单煎与共煎化学成分的差异。在茵栀黄质量控制基础上，阐述单煎、共煎对其化学成分的影响，为该经方的临床使用提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪；真空冷冻干燥机(Pilot5-8L北京博医康实验仪器有限公司)；十万分之一分析天平、万分之一分析天平FA2204B(上海精科仪器有限公司)；RE-3000型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；KQ-250型超声波清洗器(功率250W，频率40kHz，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 黄芩苷(批号110715-201318，纯度≥93.3%)，汉黄芩苷(批号112002-201702，纯度≥98.5%)，绿原酸(批号110753-201415，纯度≥96.2%)，购于中国食品药品检定研究院；栀子苷(批号MUST-16020401，纯度≥99.03%)，新绿原酸(MUST-12113001，纯度≥98%)，隐绿原酸(MUST-13013002，纯度≥98%)，异绿原酸A(MUST-18040105，纯度≥99.29%)，异绿原酸B(MUST-18031602，纯度≥99.05%)，异绿原酸C(MUST-18031603，纯度≥99.84%)，黄芩素(MUST-16031618，纯度≥99.58%)，芦丁(批号MUST-16031813，纯度≥98.16%)购自成都曼斯特生物科技有限公司；千层纸素A苷(PS-011092，纯度≥98.0%)购于成都普思生物科技有限公司。茵栀黄汤各样品(自制)，乙腈、甲醇为色谱级、超纯水自制。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合对照品溶液：分别取对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，配成新绿原酸 0.010 mg/mL、绿原酸0.15 mg/mL、隐绿原酸0.024 mg/mL、栀子苷0.27 mg/mL、芦丁0.078 mg/mL、异绿原酸A 0.060 mg/mL、异绿原酸B 0.012 mg/mL、异绿原酸C 0.072 mg/mL、黄芩苷0.31 mg/mL、千层纸素A苷0.050 mg/mL、汉黄芩苷0.72 mg/mL、黄芩素0.056 mg/mL的对照品混合溶液。

2.1.2 茵栀黄汤制备：按茵陈18 g，栀子12 g，黄芩、金银花各8 g称取，用传统方法煎煮2次，一煎加水量为药材量12倍，浸泡30 min，微沸煮30 min，二煎加水量为10倍，微沸煮20 min，过200目筛，合并滤液，减压浓缩至料液比为1∶2，冷冻干燥得干膏粉。

2.1.3 供试品溶液的制备：取干膏粉约0.2 g，精密称定，加70% 甲醇25 mL，超声10 min，取出，放冷，补重，滤过即得供试品溶液。

2.1.4 茵栀黄汤单煎样品溶液制备：称取茵陈18 g，栀子12 g，黄芩、金银花各8 g，按照“2.1.2”项下工艺参数分别进行煎煮，过滤后合并各单味饮片提取滤液，按照“2.1.3”项下制备茵栀黄汤单煎样品溶液。

2.1.5 单味药材样品溶液制备：分别称取茵陈18 g，栀子12 g，黄芩、金银花各8 g，按照“2.1.2”项下工艺参数分别制备各单味药材样品，按照“2.1.3”项下制备茵栀黄汤各单味药材样品溶液。

2.1.6 缺味样品溶液制备：分别按处方比按照“2.1.2”项下方法分别制备缺茵陈、缺栀子、缺金银花、缺黄芩的缺味样品，按照“2.1.3”项下制备茵栀黄汤缺味样品溶液。

2.2 经方茵栀黄汤HPLC指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件：色谱柱Agilent Eclipse plus-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，A相乙腈，B相0.1%磷酸水溶液；梯度洗脱：0～10 min，7%→10%A；10～15 min，10%A；15～40 min，10%→20%A；40～65 min，20%→23%A；65～90 min，23%→40% A；检测波长为238 nm；进样量为10 μL；流量1.0 mL/min；柱温 30 ℃。

2.2.2 精密度：取同一供试品，按“2.2.1”下色谱条件，连续6次进样，以10号色谱峰栀子苷为S参照，各共有峰相对保留时间RSD 为0.05%～0.93%，相对峰面积 RSD为0.12%～2.78%，RSD小于3%，精密度良好。

2.2.3 稳定性：取同一供试品，按“2.2.1”项下色谱条件，分别测定 0、2、4、8、16、24 h稳定性 ，以10号色谱峰栀子苷为S参照峰，各共有峰相对保留时间RSD 0.07%～1.27%，相对峰面积RSD 0.31%～2.74%，RSD小于3%，供试品在24 h内稳定 。

2.2.4 重复性：取同一批样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品，按“2.2.1”项下色谱条件进样，以10号栀子苷为S参照峰，各共有峰相对保留时间 RSD 为0.08%～0.21%，相对峰面积 RSD 为0.16%～2.93%，RSD 小于3% ，重复性良好。

2.2.5 茵栀黄汤指纹图谱的建立及相似度评价：制备12批次茵栀黄汤样品(S1～S12)供试品溶液，按“2.2.1”项下条件测定，对12批 茵栀黄汤的HPLC 图谱进行分析，生成对照图谱，选择27个色谱峰作为茵栀黄汤对照图谱共有峰，其中栀子苷(10号峰)作S参照峰，计算12批次样品相似度，结果详见表1。相似度在0.933以上，由整体性色谱峰可知，12批茵栀黄汤样品未受不同产地药材影响，化学成分组成相对稳定[8-11]。

表1 12批茵栀黄汤指纹图谱相似度

2.2.6 色谱峰指认与归属：根据混合对照品与茵栀黄汤对照色谱图比对，12个色谱峰得到确定，4-新绿原酸、6-绿原酸、8-隐绿原酸、10-栀子苷、13-芦丁、15-异绿原酸B、16-异绿原酸A、18-异绿原酸C、20-黄芩苷、25-千层纸素A苷、26-汉黄芩苷、27-黄芩素。

将单味药材茵陈、栀子、金银花、黄芩以及各缺味样品按照“2.2.1”项色谱条件进行测定，将茵栀黄汤与各单味药材、缺味样品色谱图进行叠加，进行各色谱峰归属。其中茵陈贡献8个色谱峰，栀子贡献8个色谱峰，黄芩贡献8个色谱峰，金银花贡献12个色谱峰；其中6号色谱峰为茵陈、栀子、金银花共有；4、8、9、15、16号色谱峰为茵陈与金银花共有，14号色谱峰为栀子与黄芩共有；2号色谱峰为茵陈特有，1、3、5、10、19、21号色谱峰为栀子特有，7、11、12、13、17号色谱峰为金银花特有，20、22、23、24、25、26、27号色谱峰为黄芩特有。结果详见表2。

表2 色谱峰归属结果

2.3 茵栀黄汤单煎与共煎化学成分比较 取3批药材，分别制备3批单煎与共煎样品，按“2.2.1”项色谱条件进样分析，对3批单煎与共煎的HPLC 图谱进行分析，结果各指纹图谱的相似度均在0.960以上，二者的化学成分基本一致。详见表3。对单煎与共煎3批色谱峰面积均值大小以及相对峰面积比进行比较，共煎后未发现新的化合物，单煎和共煎化学成分相同，而峰面积不同。单煎峰面积小于共煎的有13个，为3、5、6、7、8、9、11、12、13、15、16、17、18色谱峰，主要来源于茵陈与金银花；单煎色谱峰面积值大于共煎的有9个，1、4、14、20、21、23、25、26、27主要来源于黄芩与栀子；单煎与共煎峰面积比值无明显差异的有5个，为2、10、19、22、24色谱峰。

表3 茵栀黄汤单煎与共煎样品指纹图谱相似度

采用统计学 Dunnett's T3对数据进行配对t检验，检验结果P<0.05，差异具有显著性，有统计学意义的色谱峰只有27号峰(黄芩素)，黄芩素为黄芩特有，其单煎中峰面积值为共煎液的2倍。详见表4。

表4 茵栀黄汤单煎混合液与共煎样品溶液HPLC图峰信息 (n=3)

3 讨论

3.1 茵栀黄汤指纹图谱建立 本实验采用高效液相色谱法采集12批次样品色谱图，构建了茵栀黄汤的指纹图谱，12批样品相似度较高(大于0.933)，说明药材的不同产地及不同批次对茵栀黄汤所含化学成分未造成差异性影响，所含化学成分较稳定。

3.2 单煎与共煎化学成分比较 采用3个不同批次药材分别制备3份茵栀黄汤单煎混合与3份共煎样品，单煎与共煎，相似度大于0.960，说明二者具有良好的相关性，处方药味共煎并未产生新的化学成分。通过单煎与共煎相同量下峰面积值进行比较，发现二者峰面积具有一定的差别，但具有统计学意义的色谱峰只有27号色谱峰(黄芩素)，单煎混合液中的峰面积值为共煎液的2倍，推测茵栀黄汤共煎液中某些成分抑制了黄芩素的溶出，其他色谱峰峰面积差异均无显著性。

本实验建立经方茵栀黄汤的HPLC指纹图谱，共有色谱峰涵盖了复方的所有药味，各药味均具有特有峰，不仅可反映茵栀黄汤的整体化学成分信息，并对所有药味的质量均具有控制，使其质量评价科学合理。在指纹图谱研究基础上，通过相似度评价，分析茵栀黄汤单煎混合液以及共煎液的差别，二者在整体化学成分组成上无差异。