DNA错配修复蛋白缺失与Ⅱ、Ⅲ期结肠癌根治术后复发转移、预后的关系研究

蔡郁辉 刘金波 曹 阳 张廷涛 晁宏伟

结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈明显的上升趋势，近年来随着手术理念的更新、新辅助治疗方案的改进及腹腔镜操作技术的进步，结肠癌患者的总体生存期得到明显提高[1]。但结肠癌术后的复发转移仍然是影响患者长期生存的重要因素。DNA错配修复蛋白(MMR)参与了多种重要的生物学过程，其完整表达对保证细胞遗传物质的稳定性具有重要意义[2]。若DNA错配修复系统出现缺陷则可能使细胞出现微卫星不稳定，突变率显著提高[3]。目前，关于MMR蛋白表达状态与结肠癌患者预后的关系，在不同的研究中存在着截然相反的研究结论[4-5]。因此，我们回顾性分析了2006年3月至2012年1月我院收治的294例行结肠癌根治术的患者临床资料，探讨MMR缺失与Ⅱ、Ⅲ期结肠癌根治术后复发转移及预后的关系，以期能为临床判断患者预后提供更多、更准确的临床指标。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2012年3月至2018年1月濮阳市人民医院普外一科收治的行结肠癌根治术的患者资料。纳入标准：①腺癌。②术后病理检查确认为Ⅱ期或Ⅲ期。③术前未行放化疗或生物治疗。④行根治性手术治疗。排除标准：①同时合并有其他恶性肿瘤或有恶性肿瘤病史。②围术期死亡的病例。③临床资料完整或随访数据不全。④患有严重脏器功能疾病，如心力衰竭、肾功能不全等。⑤家族性遗传性结肠癌。⑥术后化疗非FOLFOX、5-Fu/LV方案。最终，共纳入294例患者，其中男性201例，女性93例。年龄30～82岁，中位年龄59岁。肿瘤分化以中、高分化为主，共228例，低分化66例。Ⅱ期、Ⅲ期分别有128例、166例。

1.2 主要试剂

MLHl鼠抗人单克隆抗体、MSH2鼠抗人单克隆抗体、MSH6鼠抗人单克隆抗体、PMS2鼠抗人单克隆抗体，均采购于美国Abcam公司。DAB显色试剂盒、免疫组化SP试剂盒分别购自武汉博士德生物工程有限公司、美国Zymed 公司。一抗工作浓度设置为1∶100。

1.3 免疫组化检测及结果判定

取组织，经甲醛固定、石蜡包埋处理后，切片。脱蜡、水化：采用恒温烤箱常规脱蜡处理，并快速采用浸入二甲苯中，依次进行由高到低不同浓度乙醇进行水化处理。抗原修复：采用双氧水孵育，并经高温(电磁炉1000 w，加热2 min)抗原修复液修复组织细胞抗原，之后放入凉水中，静置，待到自然冷却。丢弃抗原修复液，依次进行PBS冲洗(3遍×3 min)、双氧水孵育(3%,静置15 min)、蒸馏水冲洗、PBS浸泡(3遍×3 min)等步骤；滴加工作液，室温孵育10 min，甩去工作液，加一抗室温孵育2 h，PBS冲洗(3 min×3次)。加二抗，孵育20～30 min(37 ℃)，采用PBS冲洗(2 min×3次)。显色，DAB显色，苏木精精染(20 s),自来水冲洗(30 min)，采用由低到高浓度酒精梯度脱水，透明、封片、镜检。以PBS代替一抗设置阴性对照，以正常大肠黏膜上皮表达设置阳性对照。进行半定量分析，以出现棕色颗粒为HMGA2阳性标准。染色强度无染色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别计0～3分。同时每张切片在高倍镜下观察时，随机选取10个视野，计数100个细胞，公式：细胞阳性率=阳性细胞/同类细胞总数×100%。根据阳性率进行计分，0(0分)、<25%(1分)、25%～50%(2分)、50%～75%(3分)，>75%(4分)。两者相乘，根据乘积结果分级：“-”(0分)判定为MMR表达缺失，“+”(1～4分)、“++”(5～8分)判定为MMR低表达，“+++”(9～12分)判定为MMR高表达。

1.4 统计学分析

应用SPSS 20.0软件分析，MMR状态与患者临床病理参数关系分析采用卡方检验，多因素分析采用Logistic风险模型。影响复发转移及总体生存率的危险因素分析采用Cox单因素及多因素模型进行。 生存分析采用kaplan-Meier分析，并采用Log-rank 检验比较MMR状态对患者复发转移率、总体生存率的影响。检验水准α=0.05。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MMR状态单因素分析

MMR状态与患者肿瘤部位、分化程度、分期相关(P<0.05)。但与患者性别、年龄、手术切除淋巴结数量、治疗模式、化疗周期无关(P>0.05)，见表1。

表1 MMR状态与患者临床病理参数关系的单因素分析/例

2.2 MMR状态与患者临床病理参数关系的多因素分析

将上述单因素分析中有意义的指标纳入Logstic回归模型进行多因素分析，结果发现肿瘤部位、分化程度、分期均是影响HMGA2蛋白表达的独立性危险因素(P<0.05)，见表2。

表2 MMR状态与患者临床病理参数关系的多因素分析

2.3 影响预后单因素分析

年龄、T分期、分化程度、N分期均为影响患者总体生存率、复发转移率的危险因素。总体生存率与MMR状态有关，但复发转移率与MMR状态无关。见表3。

表3 影响预后单因素分析/例

2.4 影响患者复发转移率、总体生存率的多因素分析

多因素分析结果显示，仅有N分期是影响患者复发转移率的独立性危险因素。仅有肿瘤分化程度、N分期、MMR状态是影响患者总体生存率的独立性危险因素。见表4。

表4 影响患者复发转移率、总体生存率的多因素分析

2.5 MMR状态对患者无病生存率及总体生存率的影响

至随访截止日期，220例pMMR患者中，69例出现复发转移(31.4%)，74例dMMR患者中，13例出现复发转移(17.6%)，两组患者的无病生存率差异具有显著统计学意义(χ2=5.240，P=0.022)。见图1。220例pMMR患者中，48例死亡(21.8%)，74例dMMR患者中，9例死亡(12.2%)。两组患者的总体生存率差异具有显著统计学意义，(χ2=3.934，P=0.047)，见图2。

图1 pMMR组与dMMR组5年无病生存曲线 图2 pMMR组与dMMR组5年总体生存曲线

3 讨论

结肠癌具有高度异质性，目前仅有微卫星不稳定检测[6]、鼠类肉瘤病毒癌基因检测[7]、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源B基因[8]检测可应用于结肠癌分期及预后判断。其中，DNA复制中的错配修复系统异常可导致微卫星不稳定，在约85%的遗传性非息肉病性结直肠癌患者中存在着DNA序列的不当表达[9]。然而，在散发性结直肠癌中，微卫星不稳定也有着一定的检出率。国内针对MMR在散发性结肠癌中表达的研究较少，在我们的研究中，294例患者中，74例患者存在MMR表达缺失(25.2%)，阳性率略低于文献报道。我们推测这可能与许多研究者均采用了敏感性、特异性更高的逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)等特异性更高的检测方法有关。同时，文献数据几乎全部来自于国外，中国的研究数据较少，无法排除结肠癌表达的种族性、地区性差异。

单因素分析结果显示，MMR表达状态与患者肿瘤部位、分化程度、分期相关。多因素分析结果发现，肿瘤部位、分化程度、分期是影响MMR表达状态的独立性危险因素。肿瘤分化程度越低、分期越高，MMR表达缺失的发生率就越高。这与Hinrichsen[10]，Lewis[11]的研究结论一致。我们推测这可能与上皮钙黏蛋白基因的转录受生长因子β信号通路中的 Snail、Twist等基因调控机制相关。MMR表达缺失会抑制上皮钙黏蛋白基因转录，促进细胞间极性消失而诱发上皮-间质转化(EMT)，而EMT正是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。

在一项大型的多中心的回顾性分析中发现[12]，结直肠癌4中分子亚型CMS2～4的信号通路、遗传学特征、临床特征存在明显差异。CMS1存在微卫星不稳定的特征，好发于结肠近端，预后较差。CMS2则好发于远端结肠，存在WNT/MYC途径的异常激活。CMS3也常合并存在微卫星不稳定，且伴有KRAS突变。CMS4则以间质浸润为特征。研究发现，存在微卫星不稳定的相关肿瘤组织能产生新蛋白，其加工后的肽段可由MHC-1呈递，因此，微卫星不稳定虽然可影响患者预后，但未来有可能免疫治疗的重要靶点。在我们的研究中发现，年龄、分化程度、T分期、N分期是影响患者复发转移率、总体生存率的危险因素。MMR状态与患者总体生存率相关，但与复发转移率无关。进一步的多因素分析结果显示，仅有N分期是影响患者复发转移率的独立性危险因素。仅有肿瘤分化程度、化疗与否、N分期、MMR状态时影响患者总体生存率的独立性危险因素。这表明。MMR表达缺失可作为判断结肠癌患者预后的1个可靠指标。

综上所述,肿瘤部位、分化程度、分期与MMR表达状态密切相关。MMR表达缺失患者预后明显较差，可作为判断患者预后的1个潜在标志物。但本研究为单中心研究，且采用的是敏感性较低的免疫组化法，未来在多中心联合、增加样本量、改进检测技术的基础上，或能为MMR与结肠癌关系的研究提供更具说服力的临床证据。