BEX2介导细胞自噬通路与小鼠结肠癌的分级、疗效及预后的相关性

谷雅川 孙雪花 宋立云

结肠癌(colorectal cancer,CRC)作为消化道常见的恶性肿瘤，在全球各个国家均具有较高的发病率和病死率。结肠癌患者的治疗和预后直接受到结肠癌细胞的增殖、浸润以及转移侵袭的影响[1-2]，因此，尽早的诊断出结肠癌细胞转移、侵袭，从而针对性地进行预防、治疗结肠癌，可改善患者预后[3-4]。本研究通过检测 BEX2介导细胞自噬通路在小鼠结肠癌细胞中的表达情况，并分析结肠癌转移、侵袭与BEX2的相关性，并评价其介导细胞自噬通路与小鼠结肠癌的分级、疗效及预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 小鼠结肠癌模型构建

选取60只SD小鼠，均进行二甲肼颈背部皮下注射，注射频率1次/周，连续5周，建立结肠癌小鼠模型，并给予奥沙利铂15 mg/kg，腹腔注射，每周2次，连续给药8周。

1.2 免疫组化检测

将小鼠病理切片标本取出，用含有5%血清的室温封闭40 min，然后在4 ℃情况下加入单克隆抗体BEX2、LC3-Ⅱ和碱性磷酸酶二抗孵育。利用PBS清洗再加入SP，和DAB恒温显色封片。BEX2、LC3-Ⅱ的主要阳性表达细胞占计数细胞百分率≤10为阴性表达；>10为阳性表达。

1.3 Real-Time PCR检测方法

小鼠结肠癌细胞中的LC3-Ⅱ以及BEX2mRNA表达采用Real-time PCR法检测。取相对定量法以及阈值循环数(cycle threshold,CT)值比较法，算出不同样本间LC3-Ⅱ、BEX2、mRNA相对百分比。

1.4 WesternBlot检测方法

将小鼠结肠癌组织收集后再提取蛋白，测定蛋白的浓度。然后利用10%聚丙烯酰胺凝胶将不同组别的蛋白样品进行电泳并转至PVDF膜上，采用脱脂奶粉对PVDF膜进行40 min封闭，加入LC3-Ⅱ、BEX2一抗过夜。1天后取出PVDF膜，用TBST洗膜，再加入二抗孵育60 min。用TBST洗膜2次。最后加入ECL显色液显色，扫描各泳道条带的灰度，利用软件计算其对应的蛋白表达量。

1.5 统计学分析

用SPSS 22.0软件处理本实验的数据结果，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验进行组间比较。以P<0.05为标准，说明数据比较具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

正常组织BEX2的阳性率为18.33%(11/60)，而结肠癌组织中则为75.00%(45/60)，结肠癌组织中表达较正常组织明显上升(χ2=38.71,P<0.05)。LC3-Ⅱ在结肠癌组织及正常组织中的阳性率分别为26.67%(16/60 )和66.67%(40/60)，结肠癌组织中LC3-Ⅱ的表达明显较正常组织下降(χ2=19.29,P<0.05)。小鼠治疗后的结肠癌组织中的平均BEX2光密度明显较治疗前下降；而平均LC3-Ⅱ光密度明显较治疗前升高(P<0.05)。见表1。

表1 免疫组化蛋白光密度检测结果

2.2 Real-Time PCR检测BEX2和LC3-Ⅱ mRNA结果

小鼠结肠癌组织中的BEX2 mRNA表达较正常结肠组织显著升高，而LC3-Ⅱ mRNA表达含量显著降低(P<0.05)。小鼠治疗后的结肠癌组织中的BEX2 mRNA表达量明显较治疗前下降；而LC3-Ⅱ mRNA表达量明显较治疗前升高(P<0.05)。见表2。

表2 Real-Time PCR检测结果

2.3 WesternBlot检测BEX2和LC3-Ⅱ蛋白含量结果

小鼠结肠癌组织中的BEX2蛋白表达较正常结肠组织显著升高，而LC3-Ⅱ蛋白表达含量显著降低(P<0.05)。小鼠治疗后的结肠癌组织中的BEX2蛋白表达量明显较治疗前下降；而LC3-Ⅱ蛋白量明显较治疗前升高(P<0.05)。见表3。

表3 WesternBlot检测结果

2.4 BEX2和LC3-Ⅱ与结肠癌临床特征、疗效和预后的相关性

LC3-Ⅱ以及BEX2的阳性表达与结肠癌的浸润深度、淋巴结转移、分化程度、Dukes分期、是否远处转移以及TNM分期呈现显著相关性 (P<0.05)。见表4。

表4 BEX2和LC3-Ⅱ与结肠癌侵袭转移的相关性/只

3 讨论

BEX2 作为BEX家族的成员，主要发挥着调节细胞的转录、增殖等信号通路的作用[5-6]。近年来，越来越多的研究证明了BEX2与肿瘤发生具有相当密切的关系，且在不同类型的肿瘤中发挥的作用并不相同。目前，关于结直肠癌组织中BEX2发挥何种功能尚未见报道。深入分析BEX2在结直肠癌中作用机制不仅能够进一步了解结直肠癌发生、发展生物学特征，亦可为结直肠癌患者治疗提供新的靶点。有证据表明BEX2可以抑制线粒体凋亡。BEX2的表达与结直肠癌的TNM分期呈正相关，有实验证实过表达BEX2可通过NF-kB信号通路增强肿瘤细胞的增殖能力和侵袭，克隆形成能力和致瘤能力，抑制BEX2表达在体外和体内都能抑制肿瘤的生长[7-8]。细胞的自噬类似于细胞衰老、凋亡，作为细胞生命周期中的重要生物学环节之一，该过程在生物的生长、发育过程中普遍存在。异常的细胞自噬现象会造成癌细胞的发生。自噬是一种所谓的“自噬”细胞机制，它涉及清除错误折叠的蛋白质，防止错误折叠的蛋白质和受损细胞器的毒性积累，并通过实现细胞的新陈代谢需求来实现自我吞噬[9-10]。最近的研究表明，不同类型的癌细胞在抗癌治疗后会经历自噬，与肿瘤的发生发展密切相关[11]。因此，由BEX2介导自噬现象越来越受到人们的关注。

本研究结果表明，BEX2在结肠癌组织及正常组织中的阳性率分别为75.00%(45/60)和18.33%(11/60)，BEX2在结肠癌的表达明显高于正常组织(P<0.05)。小鼠治疗后的结肠癌组织中的平均BEX2光密度、BEX2蛋白和mRNA表达量均明显较治疗前下降(P<0.05)。说明，BEX2可调节细胞生长传递持续性促有丝分裂信号，导致肿瘤细胞不断增殖和分裂。BEX2的阳性表达和结肠癌的浸润深度、淋巴结转移、分化程度、Dukes分期、是否远处转移以及TNM分期相关性显著(P<0.05)，说明BEX2异常高表达和肿瘤的浸润、分期、转移以及治疗预后等行为密切相关。LC3-Ⅱ基因是介导细胞自噬的主要蛋白，参与调节细胞自噬的过程，并介导细胞凋亡的发生。本研究结果表明，LC3-Ⅱ在结肠癌组织及正常组织中的阳性率分别为66.67%(40/60)和26.67%(16/60)，LC3-Ⅱ在结肠癌的表达明显低于正常组织，说明LC3-Ⅱ表达的降低或突变与肿瘤浸润、转移和不良预后密切相关。说明自噬可能是在肿瘤进展的早期阻碍肿瘤发生，自噬的缺陷会损伤细胞内环境维持稳定的能力，从而活化癌基因，让抑癌基因失活，细胞中积累了大量的衰老细胞器，从而将正常细胞转变为不正常的癌细胞。本研究结果显示LC3-Ⅱ和小鼠结肠癌浸润深度、分化程度、是否发生远处转移以及淋巴结转移关系密切，说明浸润深、高分化、发生淋巴结转移及远处转移的结肠癌患者 LC3-Ⅱ 表达异常升高。

小鼠结肠癌组织中BEX2、LC3-Ⅱ异常表达与肿瘤转移密切相关，可作为预测结肠癌分级、疗效及预后的分子生物学靶点。