癫痫小儿认知功能与血清蛋白激酶C 表达水平的相关性分析

王葆辉 耿丽娟 刘 俊

开封市儿童医院，河南 开封475000

癫痫是一种神经系统常见病，由已知或未知病因引起，以脑部神经元高度同步化，伴自限性异常放电为特征［1-3］。小儿由于神经系统发育不完善，容易因外伤或不明原因而诱发癫痫。流行病学资料显示，我国0～14 岁人群癫痫的患病率约0.345%［4］，癫痫的反复发作造成神经细胞受损，长期的痫性放电可引起大脑结构功能以及突触可塑性的改变，致患者的认知、情感、行为等功能异常［5-6］，但目前癫痫的治疗效果不尽如人意，易迁延不愈发展为慢性难治性癫痫，影响患儿终生，故寻找新的可行途径尤为重要。

蛋白激酶C（protein kinase，PKC）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族［7］，根据序列同源性和辅因子可将其分为3个亚组。经典的PKC亚组需要结合钙和二酰基甘油（DAG）才能激活，并包含同工型PKC α、-βⅠ和-βⅡ（或由同一基因剪接）和-γ［8］。相反，新型PKC 亚组的成员（-δ、-ε、-η和-θ亚型）仅需要DAG 即可激活，而非典型PKC（-ι和-ζ异构体）则独立于钙和DAG 激活，但取决于独特的基于脂质的介质和蛋白质-蛋白质相互作用。PKC 在机体中广泛分布，可以催化多种蛋白质如膜蛋白、酶蛋白等，使底物上的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化发挥生物学效应［9］。活化的PKC对多种外部或自身剌激导致的细胞凋亡均有促进作用，海马神经元的凋亡是癫痫后认知能力受损的原因之一［10］，突触后PKC的作用底物神经颗粒素（neurogranin，NG）通过钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）等参与学习记忆的构建［11］。因此，探寻癫痫后认知能力的改变与PKC表达水平的相关性对小儿癫痫后认知改变具有一定的现实意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018-01—2019-10 就诊于开封市儿童医院的10～15 岁癫痫患儿79 例（癫痫组），同时征询正常发育同龄儿童40例为对照组。对照组男28 例，女12 例，年龄（11.23±1.45）岁；癫痫组男57例，女22 例，年龄（10.11±1.21）岁。2 组性别（χ2=0.380，P=0.592）、年龄（t=1.137，P=0.227）比较无明显差异（P＞0.05）。癫痫组患儿的诊断参照小儿癫痫诊断标准［12］，各组儿童纳入试验前均征求家属意见，并签署知情同意书。排除标准：合并凝血功能障碍者；合并严重感染性疾病者；合并恶性肿瘤者；合并先天性心脏病者；存在麻醉药物过敏史者；表达障碍或精神疾病者。

1.2 方法

1.2.1 认知功能评估量表（mini-mental state examination，MMSE）测试：2 组儿童均于静室中30 min 内独立自主完成量表，从定向力（orientation）、记忆 力（memory）、注 意 力 和 计 算 力（attention &calculate）、回忆能力（recall）以及语言能力（language）5 个维度检测各组儿童的认知功能。若遇不理解量表内容儿童，可在不干预自主答题的前提下予以解释，量表总分为0～30分。

1.2.2 血清PKC水平测定：抽取2组静脉血2 mL，使用人蛋白激酶C ELISA 试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，F16527），抽取的血液样本3 000 r/min 离心10 min，汲取上清液，1∶2稀释（取50 μL，加标本稀释液50 μL），按照说明进行标准品配制：加入1 mL蒸馏水于标准品原液中，混匀，使标准品浓度为20 ng/mL。标准管共设8 管，首先在第1 管中加标本稀释液900 μL，其余管中加入500 μL，而后在第1管中加入配置好的浓度20 ng/mL的标准品溶液100 μL，混匀，使用移液器吸出500 μL，移入第2 管中。反复上述操作进行稀释，至第7 管时从中吸出500 μL 弃去。第8管不加样作为空白对照。ddH2O 1∶10倍稀释10×标本稀释液，同时用ddH2O 1∶20 稀释洗涤液。96 孔抗体包被酶标板中每孔各加入标准品或待测样品100 μL，充分震荡混匀，置37 ℃温箱孵育120 min。弃去各孔溶液，加入洗涤液洗板4～6次，反扣于滤纸上控干液体。各孔加入一抗工作液100 μL，充分混匀，置37 ℃温箱孵育60 min。洗板，每孔加酶标二抗工作液100 μL，37 ℃温育30 min。洗板，各孔加入100 μL底物工作液，37 ℃避光孵育15 min后每孔加入100 μL终止液混匀终止反应。30 min内将酶标板置于酶标仪中，在450 nm处检测吸光值。所有OD值都应减除空白值后再行计算。以标准品2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/mL 为横坐标，OD 值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD 值在该曲线图上查出相应PKC含量，再乘以稀释倍数。

1.3 统计学分析 应用SPSS 23.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行t检验，单因素方差分析用于多组间比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 认知功能评估结果 2组定向力、注意力和计算力及语言能力比较差异无统计学意义（P＞0.05），癫痫组记忆能力、回忆能力及总评分较对照组均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01，图1）。

2.2 血清PKC 检测结果 与对照组相比，癫痫组患儿血清PKC 水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01，图2）。

图1 MMSE检测结果Figure 1 Results of the MMSE test

2.3 认知评估结果与PKC 表达水平的相关性 相关性分析显示，定向力评分结果与PKC 水平略呈负相关，差异无统计学意义（P＞0.05）；记忆力评分与PKC水平呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.000 1）；注意力和计算能力评分与PKC 水平呈正相关，差异有统计学意义（P=0.004 4）；回忆能力与PKC 水平呈正相关，且具有显著的相关性（P＜0.000 1）；语言能力与PKC水平呈正相关，相关性不显著；MMSE总评分与PKC 水平呈正相关，且具有显著相关性（P＜0.000 1，图3）。

图2 2组血清PKC检测结果Figure 2 Serum PKC test results of two groups

3 讨论

作为一种慢性中枢神经系统疾病，癫痫具有突发性、短暂性、反复发作性和刻板性的特点，表现为运动、感觉、意识、精神、行为和自主神经等不同障碍［13-14］。相关研究表明，约60%的癫痫患者于儿童时期首次发病，患病率高达5.5%，属于儿童时期最常见的慢性病［15］。研究表明，与其他慢性病（如糖尿病或哮喘）儿童相比，癫痫儿童对疾病的了解甚少［16］。最重要的是，癫痫儿童日常生活也受到严重影响，不仅在学校，而且在爱好、与其他儿童的互动和交友方面也是如此［17-18］。此外，文献报道癫痫儿童的社交技能比无癫痫的儿童差［19］。因此，有必要特别关注患有癫痫的儿童和青少年。究其原因，在此时期小儿各系统的发育均未成熟，神经系统尤为明显。痫性放电容易造成智力、认知发育畸形，且会持续至成人时期，给患儿带来终生性的损害［20-21］。

图3 MMSE评分与PKC水平的相关性分析 A：定向力与PKC的相关性；B：记忆力与PKC的相关性；C：注意力和计算能力与PKC的相关性；D：回忆能力与PKC的相关性；E：语言能力与PKC的相关性；F：总评分与PKC的相关性Figure 3 Correlation analysis of MMSE scale score and PKC level. A: Correlation between orientation and PKC; B:Correlation between memory and PKC; C: Correlation between attention and computing ability and PKC; D: Correlation between recall ability and PKC;E:Correlation between language ability and PKC;F:Correlation between total score and PKC

颞叶癫痫是最常见的局灶性癫痫，占局灶性癫痫发作的36%［22-23］。在颞叶癫痫中，大脑的癫痫发作始于处理情绪和短期记忆的颞叶。既往研究表明，认知障碍和记忆力减退是颞叶癫痫的常见共病［24-26］，但颞叶癫痫相关认知功能障碍的分子机制仍不清楚［27］。研究表明，转录因子cAMP反应元件结合蛋白在记忆形成以及许多神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病和血管性痴呆）的发病机制中发挥关键作用［28-29］。cAMP 反应元件结合蛋白在大脑的神经元可塑性和长期记忆形成中的作用已有文献记载，且其对于空间记忆的形成是不可或缺的［30］。此外，cAMP 反应元件结合蛋白还调节基因的转录，包括脑源性神经营养因子、Arc 和c-fos，介导了短期和长期记忆的形成［31］。氧化损伤产生的ROS产物是炎症反应、小胶质细胞激活和炎性细胞因子释放的关键触发因素，这些反应抑制了神经发生，抑制了脑源性神经营养因子的表达，导致神经元可塑性降低和记忆形成［32］。研究表明，氧化应激在此过程中可明显降低线粒体功能、诱导神经元死亡而促进癫痫发作，导致认知障碍［33］；此外，突触可塑性的改变与相关转运蛋白的异常表达会导致因自由基积聚而引起神经元受损［34-36］，同时也增加了神经元兴奋性，从而导致异常放电及认知障碍［37-38］。相对于成人癫痫后认知障碍，小儿癫痫患者因处于神经系统的发育阶段而对正常的学习记忆能力甚至智力发育造成不可逆的影响，因此，需要特别关注小儿癫痫后的认知损伤。为了探寻小儿癫痫后认知损伤的可能干预靶点，首先需要了解患儿的认知状态，综合考虑小儿的受教育程度特点，本研究采用认知状态量表对患儿认知状态进行评估。

MMSE量表于1975年为应用于阿尔茨海默病而编制，简单易行，经过多年临床应用，已成为最广泛的认知功能评估方法之一［39］。MMSE 量表主要包括记忆力、注意力、定向力及语言能力、回忆能力、计算能力等五方面共计30条目的评估，满分为30分。国内对于脑卒中患者行MMSE 的相关应用表明，其结果具有良好的信度，总体内部一致性（Cronbach’s α系数）为0.833，可作为认知功能快速检测方法［40］。

蛋白激酶是一类将蛋白固定位点与磷酸根偶联以激活蛋白活性的生物酶家族，PKC是其中的一种，为一组由单一肽链结构组成的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶［41］。PKC 广泛分布于哺乳动物及人类的各组织中，脑中含量尤为丰富［42］。相关研究表明，PKC参与调节细胞增殖分化、神经发生等过程，在突触可塑性调节及学习与认知行为中起关键作用［43］。研究表明，PKC 家族的同工酶PKC-ε的活化在阿尔兹海默病的发展中起保护作用［44］；另外，PKC-γ在大脑中的表达主要参与调节神经可塑性，包括长时程增强（long-term potentiation，LTP）和 长 时 程 抑 制（long-term depression，LTP）的调节［45］。

本研究表明，癫痫患儿与正常患儿相比，认知能力明显受损，记忆能力与回忆能力受损尤为明显，同时癫痫患儿的血清PKC 水平也明显降低，两者存在一定的关联性。研究证实，PKC 的两种非典型亚基PKCι/λ和PKMζ在长时程增强和记忆维持中发挥不同作用，且PKMζ作用更为显著［46］，PKMζ可以通过与维持LTP相同的机制维持长时呈记忆［47］。通过主动位置的回避或放射迷宫的空间调节等操作可以诱导海马PKMζ表达的持续增加，并可以持续1 d～1 个月；另外，向海马区注射PKMζ反义寡核苷酸能够抑制PKMζ的表达增加，阻止长时呈记忆形成［48］。在抑郁大鼠模型可观察到空间学习记忆功能下降和PKC表达水平的降低，同时应用帕罗西汀治疗后可使大鼠的空间学习记忆功能恢复，PKC 表达水平也随之升高［49］。此外，PKC 的激动剂苔藓抑素-1 可以中断大鼠脑缺血缺氧所引发的细胞凋亡，增加存活细胞数量，同时也可诱导海马CA1 区的突触发生以及增加脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表达。进一步的研究表明，PKC 介导的突触重塑和修复过程一致，这一现像可以在脑缺血缺氧事件发生后维持大鼠持久的空间学习和记忆保留［50-51］。本研究MMSE 评分与PKC 表达水平的Pearson 相关性分析表明，癫痫儿童MMSE 量表的总体评分、记忆能力评分、注意力与计算能力评分及回忆能力评分与PKC 水平具有明显的相关性，若以PKC 及其家族衍生物作为小儿癫痫治疗新的切入点，或可发现新的治疗靶点。