免疫透射比浊法常见干扰因素的识别与应对策略

贾珂珂， 孙文苑， 聂 睿， 崔丽艳

（北京大学第三医院检验科，北京 100191）

免疫比浊法是将液相内的沉淀反应与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一种分析技术，常用方法为免疫散射比浊法和免疫透射比浊法。免疫透射比浊法普遍用于全自动生化分析仪，具有自动化程度高、分析时间短、成本较低等优点，然而在特定情况下，其测定结果受到一些干扰因素的影响。在生化分析仪上应用的免疫透射比浊法主要为胶乳凝集免疫比浊法（latex agglutination turbidimetric immunoassay，LTIA）和颗粒增强免疫比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA）。常见的溶血、脂血、黄疸等因素以及类风湿因子（rheumatoid factor，RF）等自身抗体、M蛋白、嗜异性抗体等均会对免疫透射比浊法产生干扰，这些干扰因素可导致待测物的结果出现假性升高或降低，如果未被识别、纠正或提示临床，就可能会给临床诊断或治疗监测提供错误的信息，导致不良事件的发生[1]。本文主要探讨了免疫透射比浊法常见的干扰类型、干扰识别及应对策略。

1 样本性状的干扰

免疫透射比浊法可通过设置双波长、样本空白、样本自动稀释等方式减少干扰因素对检测结果的影响，其对溶血、脂血、黄疸的抗干扰能力优于免疫散射比浊法[2]。对于相同的检测项目，不同检测系统的免疫透射比浊法对溶血、脂血、黄疸的抗干扰能力有差异，需要具体评估。仪器如果能自动检测血清指数，如溶血指数（hemolytic index，HI）、脂血指数（lipemic index，LI）和黄疸指数（icteric index，II），建议选择合适的评价标准，设置相应的警告值，以便给临床决策提供可靠的信息[3]。

1.1 溶血

溶血对免疫透射比浊法的干扰主要来自血红蛋白（hemoglobin，Hb）本身吸光度（A）值的干扰。Hb主要在415、540和570 nm有较强的吸收峰[4]，如果待测物的检测波长也在540 nm，那么溶血产生的Hb就会影响反应的A值。夏良裕等[3]评价了溶血对41个生化免疫项目的影响[检测仪器为AU5800全自动生化分析仪（简称AUS5800，美国贝克曼库尔特公司），试剂来自多个厂商]，其中14个项目采用免疫透射比浊法检测，结果显示，3个溶血组的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M、前白蛋白（prealbumin，PA）和RF结果均低于对照组（P＜0.05），其他项目与对照组比较，结果差异均无统计学意义（P＞0.05）或仅个别结果差异有统计学意义（P＜0.05）；综合考虑，RF的溶血警告指数设置为3（重度溶血，Hb为2.0～2.99 g/L），其他13个免疫透射比浊法项目的溶血警告指数设置为4（严重溶血，Hb 3～5 g/L），当溶血指数达到相应警告指数时，溶血对该项目的干扰可判断为有临床意义。彭凤等[2]比较了免疫透射比浊法和免疫散射比浊法检测IgG、IgM和C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）的抗干扰能力，当Hb为9.9、29.8 μmol/L时对免疫散射比浊法有明显干扰，而对免疫透射比浊法均无明显干扰。刘蕊等[5]的研究结果显示，Hb浓度越高，免疫透射比浊法检测尿白蛋白时受干扰的程度越高。

1.2 黄疸

胆红素对免疫透射比浊法的干扰主要是由胆红素及其衍生物在特定波长下产生的本底对反应A值的干扰引起的。胆红素遇光和热不稳定，可生成胆绿素、胆褐素等衍生物，在360 nm及600～900 nm处形成新的吸收峰，造成吸收曲线漂移，因此双波长分析对消除本底的效果有时会不理想[6]。

不同的商品化试剂盒抗胆红素干扰的能力不同[7-9]。采用免疫透射比浊法和免疫散射比浊法检测IgG、IgM和CRP时，胆红素对这2种方法均无明显干扰[2]。刘蕊等[5]的研究结果显示，胆红素对免疫透射比浊法和免疫散射比浊法检测尿白蛋白均呈明显正干扰，当尿胆红素浓度为16.85 μmol/L（相当于“1+”）时，对免疫透射比浊法的干扰率为22.94%，对免疫散射比浊法的干扰率为15.11%。另外，SIMONSON等[10]的研究结果显示，胆红素可干扰兔抗人单抗，而对鼠抗人单抗无影响。

1.3 脂血

有脂浊的血清样本中含有大量的乳糜微粒和极低密度脂蛋白，其对检测结果的干扰主要是由于乳糜微粒具有光散射的特性，会产生浊度，从而影响反应的A值或使产物的颜色发生变化。分光光度比色法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法均会受脂浊的影响，且受干扰的程度与浊度相关。

有研究结果显示，当检测IgG、IgM和CRP时，免疫透射比浊法对脂浊的抗干扰能力优于免疫散射比浊法[2]。国秀芝等[7]比较了3种检测胱抑素C（cystatin C，Cys C）的颗粒增强免疫透射比浊法试剂，以±10%为判断标准，乳糜浊度≤6 200 FTU时，对试剂B、C均无明显干扰；试剂A受干扰较明显，仅在乳糜浊度≤1 240 FTU时无明显干扰；对35份乳糜血清样本采用高速离心处理后，检测下层清亮血清，试剂C的所有检测结果升高，符合预期；试剂B的结果有升有降，离心前后差异无统计学意义（P＞0.05）；试剂A的结果下降，较离心前平均降低8.31%；原因可能与试剂A抗体包被的微粒子颗粒的大小有关，或与外源性乳糜颗粒和内源性乳糜微粒的成分及颗粒大小不同有关。

1.4 样本性状的识别与应对策略

目前，对样本性状的识别方法主要为肉眼识别或仪器自动检测血清指数。肉眼识别的方式依赖实验室检测人员的主观判断，不能定量，样本量较大时易疏漏，因此有较大缺陷。若采用血清指数方式识别样本性状，应关注血清警告指数的设置。仪器和试剂厂商也应在试剂说明书中提供更多关于血清指数和警告指数的信息来帮助临床[11]。表1中列举了15项常用的免疫透射比浊法项目（均为仪器配套试剂）在AU5800和cobas c701/c702全自动生化分析仪（简称cobas c701/c702，瑞士罗氏公司）上血清指数的警告指数设置，对于开放检测系统，各实验室应进行干扰实验来自行设置相关参数。

表1 15项免疫透射比浊法项目在2种检测系统上的血清性状警告指数的设置

溶血是临床不合格样本最常见的类型。实验室可以通过设置适当的副波长或采用Hb单克隆抗体处理样本来降低干扰，但此方法临床较少应用。如果用公式对结果进行校正，可能会引入新的误差，所以一般不推荐采用公式校正[1，12]。重新采血可能会因患者采血困难等因素而无法实现，重新检测也会造成结果报告时间的延迟。比较有效的方式可能是检验科与临床沟通，结合溶血指数、患者的状态、检验的目的、受影响的项目在临床决策中的地位来决定暂时采用这个受影响的结果，择期重新采血还是立即采血复查[1，13]。

对于黄疸引起的干扰，临床实验室常可通过设置合适的副波长，或对样本进行预稀释来减少黄疸对检验结果的干扰。

目前常见的去除乳糜的方法有：血清稀释法、生理盐水稀释法、高速离心法、磷钨酸-镁法、聚乙二醇法、乙醚萃取法、脂质清除剂法等[14]。HUNSAKER等[15]在3种测定铜蓝蛋白的检测系统上评价了高速离心法、脂质清除剂法和去离子水1∶5稀释法3种方法去除乳糜的效果，结果显示，高速离心法去除乳糜的效果最优；脂质清除剂法效果居中，但有脂质清除不完全的情况；稀释法效果稍差，尤其对于低值样本，稀释后可能低于分析下限，但操作最简便。HUNSAKER等[16]提示厂商提供的脂血指数是采用大豆来源的脂肪乳作为乳糜添加剂，由于人类脂蛋白种类的多样性，内源性的乳糜对应的脂血指数与厂商提供的脂血指数不一致，因此在采用厂商提供的脂血指数作为警告指数时应引起注意。

针对溶血、黄疸和脂血的干扰，实验室应因地制宜，选择可行的方案来纠正干扰。

2 内源性干扰

内源性干扰对免疫检测的干扰常被忽视和低估，尤其是在使用全自动生化分析仪或免疫分析仪进行检测时，检测量非常大，很难被识别，往往在临床医生反馈检测结果与临床表现不符时才会被发现。有患者因RF干扰导致促甲状腺激素假性升高，被误诊为甲状腺功能减低，进行了数年的治疗[17]。目前研究较多的内源性干扰物质有RF、嗜异性抗体、人抗动物抗体、自身抗体、M蛋白等。

2.1 RF

RF是目前常见的干扰免疫透射比浊法的内源性干扰物质。RF是1种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体，也可认为是一种广义的嗜异性抗体。70%～80%的类风湿性关节炎患者、一些其他结缔组织病患者[18]、5%的健康人均可出现RF水平升高[19]。RF主要为IgM型，但也有IgG、IgA、IgD和IgE型。RF对双抗体夹心法的干扰比较常见，可干扰多种免疫检测项目，如激素[17]、心肌标志物[20]、肿瘤标志物[21]、病原标志物[22]、药物[23]等。

RF对免疫透射比浊法的干扰机制主要为RF与试剂2中包被抗体的胶乳颗粒发生非特异聚集反应，造成反应体系的浊度增加。OHTAKE等[24]的研究结果显示，RF对血清CRP检测有正干扰。基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）是类风湿性关节炎的一个标志物。KITAAKI等[25]的研究结果显示，患者样本中的RF、M蛋白、嗜异性抗体会干扰MMP-3的检测。黄佳芝等[26]报道了1例RF干扰Cys C测定的病例，该患者尿素、肌酐结果均在参考区间内，Cys C异常升高；RF的检测结果为2 690 IU/mL（试剂说明书提示RF≤1 200 IU/mL对检测结果无明显干扰）；采用试剂A检测时，Cys C结果为负值，0.9%氯化钠溶液4倍稀释后Cys C结果仍异常升高（16.6 mg/L），而试剂B的Cys C检测结果为0.70 mg/L，4倍稀释后结果为0.76 mg/L，未受到RF干扰。因此，试剂中是否添加足够的抗RF抗体直接影响其抗RF干扰的能力。

2.2 嗜异性抗体

嗜异性抗体是由已知或未知抗原刺激人体产生的一类具有足够滴度、能与多个物种的Ig发生相对弱结合的多重特异性Ig。采用免疫学方法的检测试剂使用的抗体大多为动物来源，嗜异性抗体可与多种动物Ig的Fc或Fab表位非特异性结合。嗜异性抗体干扰免疫学检测的机制为：（1）嗜异性抗体可同时结合标记抗体和捕获抗体，使检测结果假性升高；（2）嗜异性抗体分别结合捕获抗体或标记抗体，干扰反应中抗原的识别，使检测结果假性降低[27]。嗜异性抗体可影响所有类型的免疫测定方法。在免疫透射比浊法试剂中，一般在试剂2中含有包被检测抗体的胶乳颗粒，嗜异性抗体可结合该检测抗体，发生聚集反应，使浊度升高，对检测造成正干扰。

2.3 人抗动物抗体

人抗动物抗体是一种高亲和力的特异性多克隆抗体，一般具有明确的动物血清接触史或是使用了动物来源的生物制剂等，包括人抗鼠抗体、人抗兔抗体等，主要为IgG或IgM型。人抗动物抗体可视为一种广义的嗜异性抗体。通常所指的嗜异性抗体针对的抗原不确定，并且与抗原结合较弱，而人抗动物抗体针对特定的动物抗原，并且与靶抗原亲和力较高。人抗动物抗体对于免疫学检测方法的干扰机制与嗜异性抗体基本相同。当试剂中抗体的动物来源与患者血清中人抗动物抗体针对的动物来源一致时，这种干扰更为明显，如在心肌肌钙蛋白的检测中，人抗小鼠抗体是一个重要的干扰来源[28]。有研究结果显示，在用酶联免疫吸附试验和免疫浊度法检测患者D-二聚体时，酶联免疫吸附试验的检测结果低于诊断临界值，而免疫浊度法的检测结果高于诊断临界值，原因是患者血清中存在人抗鼠抗体，干扰了免疫浊度法的检测，造成假阳性的结果[29]。

2.4 自身抗体

自身抗体主要干扰对应的自身抗原的检测，如抗胰岛素抗体可干扰胰岛素的检测[30]，抗心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）抗体可干扰cTnI的检测[31]。这些项目大多采用化学发光法，尚无免疫透射比浊法检测试剂，因此相关的干扰报道较少见。RF是一种自身抗体，也可视为一种广义的嗜异性抗体，其造成的干扰在前文已提及。

2.5 M蛋白

M蛋白是由浆细胞或B淋巴细胞单克隆恶性增殖产生的一种异常Ig。M蛋白可在特定条件下形成沉淀，干扰分光光度比色法、比浊法和免疫学检测方法。M蛋白可对血糖、γ-谷氨酰基转移酶、总胆红素、高密度脂蛋白胆固醇、CRP、Ig等项目[30-33]以及凝血功能实验[34]、药物检测[35]等产生明显干扰。

沈敏娜等[33]评价了M蛋白对24种常规生化项目的干扰，提示M蛋白对CRP的干扰程度与M蛋白浓度无关，而CRP浓度越高，负干扰越严重。M蛋白干扰出现的频率与M蛋白浓度和类型相关，干扰常见于lgG λ和κ型，且M蛋白浓度越高，出现干扰的频率越高。干化学分析仪检测不受M蛋白的干扰，可作为复检的选择，也可用0.9%氯化钠溶液稀释的方法去除M蛋白干扰。SMOGORZEWSKA等[32]发现M蛋白干扰主要发生在反应的第1步，即试剂1与含M蛋白的血清样本发生沉淀反应，形成浊度，造成终点法的A值升高，产生正干扰（如总胆红素），或造成两点法的本底过高，产生负干扰（如高密度脂蛋白胆固醇）；而用稀释的方式只能部分纠正M蛋白对反应的干扰，因此尝试在胆红素反应曲线的第12和14点设置A值报警提示参数，如果此2点的A值＞0.035则报警提示[32]。该思路也可用于免疫透射比浊法，但常规实验室自行设置参数有一定难度，如果仪器或试剂厂商能提供这样的参数将有助于临床实验室识别M蛋白的干扰。某些试剂厂商也尝试调节试剂pH值和离子强度来减少蛋白沉淀，或添加表面活性剂来促进蛋白质溶解[36]，但并不能完全消除M蛋白的影响。有研究结果显示，相对于免疫散射比浊法，免疫透射比浊法受M蛋白干扰更明显，其原因可能是免疫散射比浊法在检测前先对样本进行预稀释，降低了M蛋白的干扰[37]。

2.6 内源性干扰的识别与应对策略

内源性抗体或Ig干扰可导致多种生化、免疫项目出现错误结果，为临床的诊断、治疗提供错误信息，因此实验室应关注文献报道过的受干扰项目或方法，注重与临床的沟通，同时在下列情况中应考虑是否有内源性抗体或Ig的干扰：（1）临床反馈患者的检测结果与临床表现不符合；（2）同时检测的临床意义相似的几个指标，结果不符合，如肌酐、尿素正常，Cys C明显升高；（3）患者近期有接受单克隆抗体药物治疗、输血等；（4）患者有自身免疫性疾病史等。

当怀疑有内源性干扰时，可以采取以下措施进行确认和纠正：（1）0.9%氯化钠溶液倍比稀释，观察待测物浓度是否呈线性。但即使稀释后结果呈线性，也不能完全排除内源性抗体或Ig的干扰[38]；（2）采用不同检测系统进行复检，但当检测结果一致时，也不能完全排除，有可能都受到干扰；（3）直接检测可能产生干扰的内源性Ig，如RF、M蛋白等；（4）在样本中加入待测物，进行回收实验；（5）采用相应的抗体阻断剂，如检测前在样本中加入动物血清、动物源Ig或商品化封闭剂[20]等；（6）采用聚乙二醇对样本进行前处理，去除沉淀后再进行检测[39]。

临床实验室应注意以上措施并不能完全消除内源性干扰。随着技术的进步，检测系统的改进也是一个重要的趋势。免疫透射比浊法试剂可通过调整试剂1的pH值至3～4，或添加1～40 g/L N-羟基琥珀酰亚胺来降低RF的干扰，有的厂商在试剂1中添加抗RF抗体来结合RF，以降低干扰。试剂生产厂商应在试剂说明书中标明可能造成干扰的内源性干扰因素及抗干扰能力，以便给临床实验室更多的提示。另外，方法学的改进也是一个重要的方向，如质谱法的检测特异性高，受交叉反应的干扰较小，但不适合高通量检测的需求。

3 检测中的钩状效应

3.1 钩状效应

在抗体量恒定的溶液中加入抗原，免疫复合物的生成量随着抗原量的增加而增加，当达到峰值之后，则随着抗原量的增加而减少，这一现象被称为钩状效应，通常将抗体过量现象称为前带现象，抗原过量则称为后带现象。当待测物浓度过高时，免疫散射比浊法和免疫透射比浊法均可能出现检测结果假性降低。钩状效应是影响其结果准确性的一个重要因素。杨杰等[40]分析了13个免疫散射比浊项目和14个免疫透射比浊项目，其中RF、心型脂肪酸结合蛋白、高敏C反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、CRP的临床可见最高值可超出参考区间上限的100倍，β2-微球蛋白、RF、视黄醇结合蛋白（retinol-binding protein，RBP）、脂蛋白（a）浓度常超出分析测量范围上限，因此这些项目具有较高的发生钩状效应的风险，需引起关注。尿微量白蛋白（microalbumin，mAlb）浓度也经常超出分析测量上限[41]。杨杰等[42]对ASO、mAlb、hs-CRP、β2-微球蛋白、RBP和Cys C 6个项目分别用5种免疫透射比浊法试剂盒进行检测，结果显示，不同试剂盒的抗原过量安全范围差异很大，部分试剂盒受钩状效应影响严重。试剂盒的性能与添加抗体的浓度有关，抗体浓度越高，所能检出的抗原浓度越高，提高试剂配方中的抗体浓度是减少钩状效应的方案之一，但会增加试剂成本。

3.2 钩状效应的识别与应对策略

目前，针对钩状效应常用的解决方案一般有3种。（1）样本预稀释：如瑞士罗氏公司、德国西门子公司的检测系统中有部分项目采用此方法，将样本进行10～21倍预稀释，该对高浓度样本可有效减少钩状效应，但稀释会引入更多的分析前变异，对于低浓度样本，稀释会影响结果的准确性[40]；（2）抗原或抗体的二次添加：即在反应过程中再次加入一定量的试剂（抗体）或样本（抗原），随着反应的进行，根据时间-反应进程曲线是否发生改变、拐点的上升或下降来判断是否存在抗原过量[40]，如有过量，再进行稀释。抗原二次加入法相对较常用，瑞士罗氏公司的检测系统检测mAlb即采用此方法。但此方法会相对增加试剂成本，也会降低反应速度；（3）反应曲线特征识别和报警：根据不同项目的抗原-抗体反应动力学特征，在反应曲线的特定时间点监测生成的免疫复合物的A值，计算反应不同时段的A值变化的比值，与预设的参数进行比较，自动识别钩状效应。瑞士罗氏公司、美国贝克曼库尔特公司、深圳迈瑞公司的封闭检测系统部分项目均可提供参数采用此方式进行报警，对于开放检测系统，临床实验室可通过预实验结果在生化分析仪上自行设置参数来对钩状效应进行识别和报警[40-44]。

4 其他干扰因素

其他可能影响免疫透射比浊法的因素包括携带污染、药物等。另外，随着生物制剂应用的增多，一些单抗类药物可能直接对免疫学检测方法产生影响，或使人体产生嗜异性抗体，干扰免疫学检测方法。

5 总结

样本性状、内源性干扰、钩状效应以及药物等各种干扰因素是影响免疫透射比浊法检测结果准确性的重要因素之一。从临床实验室的角度来说，检验人员应关注和了解这些因素，重视与临床的沟通。从试剂生产厂商的角度来说，应在试剂说明书中提示该项目可能存在的干扰因素并提供解决方案。随着检测技术的进步，抗干扰试剂盒的开发，检测方法的更新换代，临床检测中的干扰问题会逐步得到解决。