肝硬化患者肠黏膜屏障功能变化与Toll样受体4、T细胞亚群的相关性分析

顾新红 马小丽

肝硬化（Cirrhosis）是由一种或多种原因引起的以肝组织弥漫性纤维化、假小叶和再生结节为组织学特征的进行性慢性肝病。失代偿肝硬化患者门静脉高压导致肠道淤血、肠粘膜屏障受损、肠道菌群易位，产生菌血症、内毒素血症，导致全身性炎症状态及多个器官功能受损。目前对Toll样受体4（TLR-4）、T细胞亚群与肝硬化患者肠粘膜屏障功能受损相关性研究比较少。现收集85例肝硬化患者的临床资料，分析不同阶段肝硬化患者肠黏膜屏障功能与TLR-4、T细胞亚群的相关性，报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集我院消化内科2016年8月～2020年8月收治的不同病因的85例肝硬化患者临床资料，其中男60例，女25例，平均年龄（63.41±8.15）岁。按照Child-Pugh 肝功能评分分为3组，观察1组（Child-Pugh A级，n=28），观察2组（Child-Pugh B级，n=29），观察3组（Child-Pugh C级，n=28）。入选标准：根据既往病史、临床症状及实验室、肝脏影像学检查均可确诊，患者积极配合治疗。家属及患者均知情且签署知情同意书，经本院医学伦理委员会审核并通过。排除标准：孕妇及哺乳期妇女，原发性肝癌、肝性昏迷及其他心、肺、肾等重要器官功能衰竭者。另选健康体检者30例作为对照组，其中男20例，女10例，平均年龄（58.32±6.67）岁。

1.2 实验室检测

1.2.1 血清TLR-4浓度测定 采用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定患者外周血TLR-4浓度（试剂盒购自宁波美康生物科技股份有限公司），检测过程按照试剂盒说明书的使用方法。

1.2.2 肝硬化患者肠黏膜损伤相关指标测定 ①血清内毒素浓度：使用动态比浊法（鲎试剂）测定。患者于清晨空腹状态下抽取外周静脉血5ml，置入无热原试管中，离心速度3 500r/min，离心时间12min。②尿乳果糖和甘露醇比值（L/M）测定：采用离子色谱法测定尿乳果糖和甘露醇浓度，并计算L/M。③D-乳酸测定：使用酶学分光光度检测，空腹状态下抽取外周静脉血离心后血浆置于试管中，采用浓度为4.6mmol/L 的NAD+碳酸盐溶液混合。待测试管中注入50μl D-乳酸脱氢酶，空白管加入50μl 蒸馏水，以空白管调零于340nm 处测定吸光度。

1.2.3 CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的测定 采用流式细胞仪及配套试剂（美国BD 公司）测定外周血CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞亚群计数。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0 统计学软件对数据进行处理，计量资料采用±s表示，比较采用多组间单因素方差分析（F检验），以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组间血清TLR-4水平、内毒素、D-乳酸及L/M的比较观察2、3组血清TLR-4浓度显著高于观察1组、对照组，组间差异有统计学意义（P<0.05）；观察3组血清TLR-4浓度显著高于观察2组，组间差异有统计学意义（P<0.05）。观察3组血清内毒素、L/M 与D-乳酸浓度高于对照组及观察1、2组，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 组间T细胞亚群检测结果比较观察1、2、3组外周血CD3+、CD4+、CD8+水平显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表1 各组TLR-4、内毒素、L/M 与D-乳酸的比较（±s）

表1 各组TLR-4、内毒素、L/M 与D-乳酸的比较（±s）

组别 TLR-4（pg/ml）内毒素（EU/ml） L/M D-乳酸（mg/L）观察1组（n=28） 4.69±0.82 0.45±0.12 0.46±0.13 4.05±0.78观察2组（n=29）17.85±3.09 0.47±0.09 0.48±0.14 4.19±0.73观察3组（n=28）38.87±5.96 0.48±0.11 0.49±0.15 4.21±0.69对照组（n=30） 4.53±0.85 0.35±0.08 0.25±0.07 3.10±0.91 F 37.57 46.36 52.15 43.33 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各组T细胞亚群检测结果的比较（±s，cell/μl）

表2 各组T细胞亚群检测结果的比较（±s，cell/μl）

组别 CD3+ CD4+ CD8+观察1组（n=28）903.12±105.01 488.69±54.98 423.69±51.02观察2组（n=29） 756.15±76.02 410.01±40.79 363.98±32.96观察3组（n=28）624.70±127.99 336.10±69.13 324.11±48.09对照组（n=30） 965.20±190.55 796.50±110.85 565.12±86.69 F 20.50 20.65 15.98 P 0.000 0.000 0.000

2.3 TLR-4、T淋巴细胞亚群与内毒素、L/M、D-乳酸相关性分析TLR-4 与血清内毒素、L/M、D-乳酸浓度呈正相关（r分别为0.532、0.487、0.512，P<0.05）；外周血淋巴细胞亚群CD3+与血清内毒素、L/M、D-乳酸浓度呈负相关（r分别为-0.492、-0.516、-0.637，P<0.05）；CD4+与血清内毒素、L/M、D-乳酸浓度呈负相关（r分别为-0.531、-0.461、-0.547，P<0.05）；CD8+与血清内毒素、L/M、D-乳酸浓度呈负相关（r分别为-0.476、-0.563、-0.621，P<0.05）。

3 讨论

肝硬化是各种慢性肝病逐渐发展到终末阶段的一种病理状态。在肝硬化阶段门静脉高压引起肠系膜上、下静脉淤血，胃肠粘膜淤血水肿破坏上皮细胞连接，粘膜屏障功能减退、破坏。研究表明[1，2]，T淋巴细胞和sIgA（浆细胞、肝脏分泌）对维护肠黏膜屏障的完整性有重要作用。在肝硬化进展过程中，肝硬化患者肠粘膜相关淋巴组织及肝枯否氏细胞处理和传递抗原、清除细菌及内毒素的免疫功能逐渐减退。肝硬化患者肠粘膜屏障功能受损和宿主免疫功能减退是肠道细菌易位的主要危险因素。细菌内毒素、L/M 及D-乳酸为常用评价肠粘膜屏障受损实验室检查指标。TLR-4是Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）亚型，可开启固有免疫应答，激活NF-κB 信号传导途径，释放炎症介质（TNF-α、IL-1β、IL-6 等），介导炎症反应，TLR-4可以用来评价肠粘膜屏障受损程度。

本研究肝硬化患者血清内毒素、L/M、D-乳酸与TLR-4、T细胞亚群变化特点及相关性，观察3组血清内毒素、L/M 与D-乳酸浓度高于对照组及观察1、2组，组间差异有统计学意义（P<0.05）。随着肝硬化病情的进展，患者血清内毒素和其它细菌代谢产物（L/M 与D-乳酸）浓度逐渐上升，表明肝硬化患者肠道内细菌大量繁殖，并进入血液。由此可见，血清内毒素在诊断肠道细菌感染方面具有较高价值。党燕等[3]研究认为，肝硬化失代偿期继发腹水感染后患者血清内毒素浓度明显升高，在诊断肝硬化腹水感染方面具有很高的敏感性和特异性。黄芬等[4]研究认为监测血清内毒素浓度可用于判断肝硬化肠源性感染的疗效。

TLR-4 属于细胞表面TLRs，对人体固有免疫应答有重要调控作用，主要分布在肝脏的肝星状细胞（HSC）膜上。表达于巨噬细胞和肝枯否氏细胞表面的TLR-4 的功能主要是识别革兰阴性菌的成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），激发炎症反应。本研究中，失代偿期肝硬化患者（观察2、3组）血清TLR-4浓度显著高于代偿期肝硬化患者（观察1组）和对照组，表明失代偿期肝硬化患者处于细菌性炎症反应状态。据此进一步分析发现，Child-Pugh C级（观察3组）失代偿期的肝硬化患者炎症反应程度高于Child-Pugh B级（观察2组）。失代偿期肝硬化患者肠粘膜屏障受损程度加重，细菌易位导致的炎症反应程度逐渐加剧。本研究表明，TLR-4表达与肠道细菌易位的发生密切相关。赵秀娟等[5]研究发现，TLR-4 血清浓度在慢性乙型肝炎和肝硬化患者中均明显升高，且在失代偿期肝硬化患者中浓度最高，本研究结果与上述文献报道结果相似。此外，陈芳等[6]认为高表达的TLR-4、TGF-β1 可能诱导参与、促进肝胶原纤维的大量合成，抑制胶原纤维降解，导致肝组织纤维化及肝硬化的发生、发展。肝硬化患者肠粘膜屏障损害发生的菌血症、炎症反应可能在一定程度上进一步加速肝硬化进程。

在人体内T淋巴细胞执行的是细胞免疫功能，外周血T细胞数量的减少可导致机体细胞免疫功能损害。肝脏具有的免疫功能是机体免疫的组成部分，肝功能失调在人体特异性免疫、非特异性免疫的紊乱中起重要作用。研究认为[7，8]，乙肝后肝硬化患者T淋巴细胞亚群（CD4+、CD8+）的变化，可作为动态指标来反映机体细胞免疫和体液免疫功能，可为乙肝后肝硬化患者的病情判断、疗效及预后的评估提供依据。本研究中，肝硬化患者外周血CD3+、CD4+、CD8+计数显著低于对照组；观察1组外周血CD3+、CD4+、CD8+计数值显著高于观察2、3组；观察2组外周血CD3+、CD4+、CD8+显著高于观察3组。我们认为，肝硬化患者体内CD3+、CD4+、CD8+数量减少与脾功能亢进有直接关系，脾脏破坏了大量的免疫细胞。有研究发现肝硬化患者免疫功能变化、Child-pugh分级变化与机体受到的炎性应激有关[9～11]。在本研究结果中，TLR-4 与内毒素、L/M、D-乳酸呈正相关；T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+与内毒素、L/M、D-乳酸呈负相关，肠黏膜屏障受损引起的菌血症、炎症反应进一步损害机体的免疫功能调节。

肝硬化患者外周血TLR-4浓度变化可以反映其肠黏膜屏障功能受损程度，同时肠黏膜损伤与T细胞CD3+、CD4+、CD8+亚群显著相关，TLR-4浓度与T细胞CD3+、CD4+、CD8+计数可作为肝硬化患者肠黏膜屏障功能损伤的评价指标。