铜绿假单胞菌lasR/rhlR基因缺陷对小鼠腹腔生物被膜感染的影响

刘晓岚 刘晓庆 荆雪宁 唐妮 景政 孔晋亮 宋志军 吴红

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是临床常见的细菌生物被膜（Biofilms，BF）相关感染致病菌。BF是细菌粘附于活性或惰性物体表面形成的高密度细菌团块，并由自身产生的粘性胞外基质包裹着的具有三维立体结构的生物群体[1，2]。生物被膜中的细菌对抗生素和宿主免疫攻击的抵抗能力大大提高，所以BF 的形成给治疗带来很大的困难[3]。而群体感应（Quorum sensing，QS）系统在BF 感染过程中发挥着非常重要的调节和协调作用。QS是指当细菌数量达到一定的密度时才能发生的感应现象，它是一种密度依赖的细菌-细胞间信号机制，由相应的信号分子与受体蛋白结合，在细菌毒力和BF 形成的调控中起着重要作用[4～8]。本实验采用QS系统完整的PAO1野生型菌株及其同源QS系统的PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株体外培养BF 感染的载体移植到小鼠腹腔，然后观察群体感应系统的lasR/rhlR基因缺陷对小鼠腹腔铜绿假单胞菌生物被膜感染致病性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验菌株铜绿假单胞菌PAO1野生型，PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型（丹麦哥本哈根大学医院临床微生物科惠赠）。

1.2 实验动物8～9 周龄清洁级健康雌性KM 小鼠，体重18～22g，广西医科大学动物实验中心提供，动物合格证号SCXK 桂2014-0002。

1.3 载体将一次性使用引流管（苏州鑫达医疗器材有限公司）切割成直径为5mm 的小圆片，高压灭菌后使用。PA 在37℃恒温摇床中培养20h，将细菌浓度调整至所需的OD600=0.05，用24 孔板每孔分别加入2.0ml 调好的菌液或生理盐水，浸泡无菌的一次性引流管圆片，37℃恒温培养20h，取出载体，生理盐水冲洗两遍备用。

1.4 试剂和主要器材LB 琼脂、LB 肉汤（均为中国陆桥技术责任有限公司提供），其他试剂均为国产分析纯。全自动血液分析仪（SYSMEX，XT-2000i），智能生化培养箱（常州市伟嘉仪器制造有限公司，SPX250），酶标仪（美国Thermo Multiskan MK3），生物安全柜（苏州净化设备有限公司，BHC-1300I-IA/B2），普析通用T6 新世纪紫外可见分光光度计（上海精密科学有限公司），SPX-3003-Ⅱ型生化恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），台式低温高速离心机（5410R，德国EPPENDOF）。

1.5 动物分组及模型建立将30 只雌性KM 小鼠标准鼠粮、随意饮水饲养1周。按照随机分配原则，分成空白对照组、PAO1野生型组、基因缺陷型组各10 只。将小鼠在4%水合氯醛腹腔0.2ml/只麻醉下，于左下腹部局部消毒后行7～8mm 切口逐层进入腹腔，将载体用无菌生理盐水轻轻冲洗后放入腹腔，缝合关腹。饲养3d，小鼠眼球后静脉采血约1.0ml 查血常规，然后处死小鼠观测以下指标：腹部细菌学和病理学变化（取出载体并轻柔地去除表面组织，生理盐水轻柔冲洗后用连续稀释法进行活菌计数；切除载体周围腹腔感染组织浸泡于10%甲醛溶液中固定，做石蜡切片常规HE染色、显微镜下观察），分析PAO1野生型和PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型生物被膜体内感染的差异。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0 软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，3组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 载体活菌计数比较小鼠腹腔植入载体取出后采用连续稀释法计算活菌计数，结果显示基因缺陷型组为（5.66±0.14）lg（cfu/ml），少于PAO1野生型组的（5.95±0.26）lg（cfu/ml）（t=2.849，P=0.016），空白对照组未培养出活菌。

2.2 血常规指标比较基因缺陷型组和空白对照组的白细胞计数明显低于PAO1野生型组，差异有统计学意义（P=0.017，P=0.024）；基因缺陷型组和空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。基因缺陷型组和PAO1野生型组单核细胞比值明显高于空白对照组，差异有统计学意义（P=0.000）；基因缺陷型组和PAO1野生型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 小鼠腹腔植入载体3d后血常规指标比较（±s）

表1 小鼠腹腔植入载体3d后血常规指标比较（±s）

注：与PAO1野生型组比较，aP<0.05；与空白对照组比较，bP<0.05

组别 白细胞计数（×109/L） 单核细胞比值（%）空白对照组 2.86±0.71a 5.46±1.60 PAO1野生型组 3.61±0.63 10.28±2.62b基因缺陷型组 2.81±0.71a 9.69±2.40b

2.3 腹腔感染组织病理学改变肉眼观，PAO1野生型组载体周围网膜、肠管等组织黏连，形成脓肿；基因缺陷型组炎症反应明显较轻，黏连少；空白对照组无明显改变。光镜下可见PAO1野生型组出现明显急性炎症反应，载体周围组织可见大量中性粒细胞浸润和少量巨噬细胞，局部可见细胞变性坏死；基因缺陷型组载体周围组织。中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，炎性反应明显较PAO1野生型组轻，无坏死。见图1～3。

图1 空白对照组腹腔载体周围网膜组织

图2 PAO1野生型组腹腔载体周围脓肿组织

图3 基因缺陷型组腹腔载体周围感染组织

3 讨论

铜绿假单胞菌生物被膜感染性疾病是一类广泛存在、涉及多学科的疾病，临床上很多慢性感染如：呼吸机相关肺炎、手术部位感染、牙菌斑、烧伤所致伤口感染、尿路感染、医院获得性肺炎等的发生均与其有关。目前发现PA 至少存在四种群体感应系统：las、rhl、iqs、pqs，这四种系统交织成一个复杂的多层次调控网络，每个群体感应系统由相应的信号分子与受体蛋白结合，从而激活与毒力因子、次级代谢和BF 成熟有关的多种基因转录，协调其特定的功能，影响铜绿假单胞菌生物被膜的形成和致病性[9，10]。las 系统即lasI/lasR 系统，能够调节多种毒力因子的表达，其中一些物质在BF 的形成过程中有重要作用，如绿脓菌素能够调控eDNA 的释放，促进BF 形成，而eDNA 在促进铜绿假单胞菌BF 形成中起重要作用，参与细菌的初始附着、黏连和BF大菌落的形成[9，11]。rhl系统即rhlI/rhlR系统，能够调控生物表面活性剂—鼠李糖脂和凝集素LecA 等的产生，在BF 形成后期对促进其成熟结构的形成及维持发挥作用。lasI 和rhlI 基因分别编码细菌群体感应信号分子，lasR 和rhlR基因分别编码转录激活子调节信号分子及下游毒力基因等的表达。此外，iqs 系统和pqs 系统也参与了铜绿假单胞菌生物被膜的形成[9，12]。有实验证明，铜绿假单胞菌QS系统的lasR/rhlR基因是参与调节成熟的铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要组成部分，影响抗生素的作用和宿主免疫功能的清除，能够调控PA 的体内致病性[6～9]。

本实验腹腔植入的载体取出后通过计算发现基因缺陷型组的活菌计数明显少于PAO1野生型组，说明相对于PAO1野生型，机体更容易清除PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株。BF 形成可以帮助它在外界环境中更好的生存，这是一个极其复杂的防御过程。小鼠腹腔感染后基因缺陷型组和空白对照组的白细胞计数相近，均明显低于PAO1野生型组，说明PAO1野生型组小鼠机体出现明显的全身炎症反应表现，而基因缺陷型组没有出现，反映PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型引起的机体全身炎症反应明显弱于PAO1野生型。而且，病理组织学大体观和镜下表现也显示基因缺陷型组的腹腔载体周围的局部炎症反应明显轻于PAO1野生型组。可见，PAO1 lasR/rhlR基因缺陷明显降低铜绿假单胞菌生物被膜的体内致病性。向青青等[13]曾使用相同的两种菌株研究铜绿假单胞菌生物膜感染对气管插管模型大鼠肺组织Foxp3、转化生长因子β1（TGF-β1）、白细胞介素10（IL-10）表达的影响，结果证实铜绿假单胞菌QS系统的lasR/rhlR基因能促进模型大鼠中PAO1 的炎症反应，促进肺组织Foxp3表达上调，并伴有TGF-β1、IL-10分泌增多，使病原菌不能被有效清除而长期存在，促使感染迁延化和慢性化，也说明QS系统对免疫系统的Th1/Th2 平衡有一定影响。关于铜绿假单胞菌生物被膜组成和调控的详细研究可以帮助我们找到能够有效防治PA 慢性感染的新型药物和方法。本实验用QS系统完整的PAO1野生型及其同源QS系统的PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株进行腹腔留置引流管载体相关的铜绿假单胞菌生物被膜感染，比较QS系统PAO1 lasR/rhlR基因缺陷PA 所形成的BF的体内致病性与PAO1野生型菌株的差异。结果显示PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株与PAO1野生型菌株感染的载体对小鼠的致病能力存在明显差异，PAO1野生型菌株的炎症反应明显更严重，小鼠相对更容易清除体内由PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株引起的感染。由此证实QS系统lasR、rhlR基因在PA 及其BF 结构的致病性和耐药性中占有重要地位。因此如果针对QS系统的lasR、rhlR基因进行铜绿假单胞菌生物被膜感染的防治会有重要的临床意义。