芹菜茎基腐病病原菌鉴定、消长动态调查与防治药剂筛选

王国荣，冯晓晓，吴慧明，曹婷婷，李 倩，郑永利

(1.浙江省杭州市萧山区农业技术推广中心，浙江 杭州311203； 2.浙江大学 农业试验站，浙江 杭州310058； 3.浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江 杭州311300； 4.浙江省植保检疫与农药管理总站，浙江 杭州310020； 5.中国计量大学 生命科学学院，浙江 杭州 310018； 6.浙江省农产品质量安全中心，浙江 杭州310003)

芹菜(ApiumgraveolensL.)是我国重要的蔬菜作物之一，适应性广，全国均有栽培。浙江省通过创建标准化示范园、品牌村、专业合作社等，芹菜种植面积逐年扩大，为广大农户带来良好的经济收益，已成为致富一方的优势产业。据文献报道，芹菜主要病害有斑枯病、软腐病、早疫病、菌核病、根结线虫病等[1-2]。然而据近年来田间调查发现，主要发生在近地面芹菜根茎部和叶柄基部的芹菜茎基腐病发病十分普遍，严重田块发病率可达100%，日益成为制约当地芹菜产业健康持续发展的重要因子。对于芹菜茎基腐病的病原菌、病情消长动态及防控技术的系统研究均未见报道。本文在对浙江省杭州市芹菜茎基腐病的病原菌分离鉴定和田间病情消长动态观测的基础上，开展了高效防控药剂筛选与田间药效试验，以期为当地芹菜茎基腐病的科学防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试样品：于2017、2018年在浙江省杭州市萧山区益农镇三围村种植基地采集具有芹菜茎基腐典型症状的样品，芹菜种子购自当地种子市场，在温室种植，取健康植株供回接试验。

药剂、培养基及仪器：29种市场常见农药制剂分别为430 g·L-1戊唑醇SC、40%丙硫菌唑·戊唑醇SC、70%甲基硫菌灵WP、30%唑醚·戊唑醇SC、20%氰烯·己唑醇SC、75%肟菌·戊唑醇WDG、40%氟菌唑WP、125 g·L-1氟环唑SC、35%氟菌·戊唑醇SC、43%氟菌·肟菌酯SC、12%苯甲·氟酰胺SC、19%啶氧·丙环唑SC、10%苯醚甲环唑WDG、25%氰烯菌酯SC、60%唑醚·代森联WDG、30%己唑醇SC、400 g·L-1氟唑菌酰羟胺·咯菌腈SC、16%二氰·吡唑酯WDG、30%苯甲·嘧菌酯SC、250 g·L-1吡唑醚菌酯EC、42.4%唑醚·氟酰胺SC、4%四氟醚唑EW、70%代森联WDG、50%嘧菌环胺WDG、25 g·L-1咯菌腈FS、41.7%氟吡菌酰胺SC、50%烯酰吗啉WP、50%啶酰菌胺WDG、15%噁霉灵AS。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)购于杭州微生物试剂有限公司，按厂商建议用法配制灭菌备用。培养箱(宁波江南GXM-358A)，离心机(Eppendorf 5424)，全自动样品快速研磨仪(上海净信JXFSTPRP-24)，PCR仪(AB veriti)，显微镜(Leica DM2500)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离鉴定和致病性测定

用铲子挖取病株，带土装入样品袋中，整体带回实验室进行病原分离鉴定。经表面消毒后以组织分离法对病原菌进行分离。将平板置于25 ℃恒温培养箱中培养至感病组织边缘长出菌丝，挑取小块菌丝转移至新的PDA平板上进行纯化培养。

挑取上述纯化培养获得的病原菌提取基因组DNA。用引物ITS 1和ITS4[3]、EF1-728F[4]和EF2[5]扩增ITS和tef1序列。扩增产物送浙江尚亚生物技术有限公司测序。将测序结果在NCBI GenBank 数据库中进行同源性比对，采用MEGA 6.0中的邻接法(neighborjoining analysis，NJ)建立病原菌系统发育树，确定病原菌的分类地位。

将纯培养并鉴定的病原菌菌株ZJUP0120、ZJUP0130、ZJUP0130N和ZJUP0141在PDB培养基中培养5 d，过滤菌丝体，制成菌丝悬浮液。取事先准备好的盆栽芹菜(30 d苗龄)，将菌丝悬浮液接种至土壤中，每盆接种10 mL，每个菌株接种5盆，以清水为对照，观察和记录芹菜发病情况，发病后的植株再次分离病原菌并鉴定。

1.2.2 田间病情自然消长动态调查

在浙江省杭州市萧山区益农镇三围村芹菜种植基地选择两个地块(B1和B2)，从幼苗移栽定植后至收获的整个生产期间进行不定期调查。每块地采用50 cm×50 cm的调查框随机选取10点，记录调查日期、病株数及调查总株数等，分别统计自然发病率。其中，B1地块的B1-CH1、B1-CH2、B1-CH3、B1-CH4、B1-CH5和B2地块的B2-CH1、B2-CH2、B2-CH3芹菜品种为黄心芹，B1地块的B1-CM1和B2地块的B2-CM1芹菜品种为梅芹。

1.2.3 室内药剂筛选

采用菌丝生长速率法，测定29种供试药剂对芹菜茎基腐病菌的菌丝生长抑制作用。将供试药剂按推荐剂量、每667 m2兑水30 L，稀释成母液备用。在融化的PDA培养基中分别加入供试药剂母液，制成含1/50推荐剂量浓度的含药PDA平板。每个药剂5个平板，冷却后在平板中央接种芹菜茎基腐病菌菌饼(Φ5 mm)1块。25 ℃避光培养6 d后测量菌落直径(需减去菌饼直径再进行计算)，计算菌丝生长抑制率，用SPSS 22.0进行方差分析，比较病原菌对不同药剂的敏感性差异。

1.2.4 田间药效试验

2019年6月在萧山伟友蔬菜生产基地，选择室内筛选具有较好防效的75%肟菌·戊唑醇WDG和70%甲基硫菌灵WP进行芹菜茎基腐病田间药效试验，供试品种为梅芹。试验设计见表1。每处理3次重复，每个小区面积不小于50 m2，各小区随机排列。用背负式电动喷雾器(容量16 L)喷雾。最后一次施药后14 d调查病株率，每小区用50 cm×50 cm调查框随机取5点，统计总株数和病株数，计算防治效果，对有显著(P<0.05)差异的，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态特征与致病性测定

调查结果表明，芹菜茎基腐病(图1)主要发生在近地面芹菜根茎部和叶柄基部。发病初期病部呈灰褐色，扩展后变成暗绿色至黑褐色，严重时受害部位变黑腐烂。病株萎蔫发黄，严重者死亡，有明显发病中心，易传播。夏季气温较高，连续阴雨天高湿时发病重。栽种病苗易引起该病流行，高湿地、连作地易成发病重灾区。

纯培养的病原菌菌落形态粉白色、浅粉色至紫色(图2-A)。挑取感病组织制片，显微镜下可见大型分生孢子镰刀形，两端渐尖(图2-B)，小型分生孢子钝圆形(图2-C、D)。

病原菌ITS、tef1在NCBI GenBank 数据库中进行同源性序列分析，从基因数据库中下载相似度高的相应基因序列，进行同源性分析，对近缘模式菌株的ITS、tef1序列进行系统发育树分析，以Nectriaceae科菌株FusicollaaquaeductuumCBS 837.85作为外群，选择最佳碱基替代模型K2+G，利用自展法检验各分支的支持率(bootstrap proportions，BP)，1 000 次重复，建立病原菌系统发育树(图3)，可见菌株ZJUP0130与尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum菌株CBS 133023聚类的分支。

图1 芹菜茎基腐病田间发病症状Fig.1 Field symptoms and pathogen morphology of celery stalk basal rot caused by Fusarium oxysporum

将分离的病原菌菌丝体悬液接种至培养30 d的盆栽健康黄心芹的土壤中，每盆接种10 mL，以清水为对照，发现4个菌株接种后芹菜均表现出不同程度的发病症状(图4)，其中ZJUP0130和ZJUP0130N较重，发病后的植株再次分离病原菌，并得到与ZJUP0120、ZJUP0130、ZJUP0130N和ZJUP0141一致的菌株，证明ZJUP0120、ZJUP0130、ZJUP0130N和ZJUP0141是引起芹菜茎基腐病的病原菌。

2.2 田间病情消长动态调查

2018年9月萧山区连作芹菜地调查结果(图5)表明，B1地块(B1-CH1、B1-CH2、B1-CH3、B1-CH4、B1-CH5)平均发病率为56.00%，以黄心芹(B1-CH5)的发病率最高，为66.63%；B2号地块(B2-CH1、B2-CH2、B2-CH3、B2-CM1)平均发病率为40.61%，以梅芹(B2-CM1)的发病率最高，为71.63%。不同品种间，黄心芹的平均发病率为50.23%，梅芹的平均发病率为65.82%。同时，不同月份发病率差异较大，2018—2019年的系统调查发现(图6)，6—9月芹菜茎基腐病的发病率较严重，10月份后发病率逐渐趋轻。

2.3 室内药剂筛选

从表2可见，29种常用杀菌剂对芹菜茎基腐病菌的抑制效果差异较大。当浓度为推荐剂量1/50时，430 g·L-1戊唑醇SC、40%丙硫菌唑·戊唑醇SC、70%甲基硫菌灵WP、30%唑醚·戊唑醇SC和75%肟菌·戊唑醇WDG对芹菜茎基腐病菌的菌丝生长抑制率均大于95%，且显著(P<0.05)大于其他药剂，表现出强烈的生长抑制活性；40%氟菌唑WP、125 g·L-1氟环唑SC、35%氟菌·戊唑醇SC的菌丝生长抑制率介于85%～95%，表现出较强的抑制活性；20%氰烯·己唑醇SC对芹菜茎基腐病菌的菌丝生长抑制率大于95%，但与40%氟菌唑WP和125 g·L-1氟环唑SC无显著性差异；其余20种药剂的菌丝生长抑制率均小于85%。聚类分析结果表明，芹菜茎基腐病菌对29种杀菌剂的敏感性分为四类，对430 g·L-1戊唑醇SC等9种药剂的敏感性强，对43%氟菌·肟菌酯SC等10种药剂的敏感性中等，对250 g·L-1吡唑醚菌酯EC等5种药剂的敏感性弱，对25 g·L-1咯菌腈FS等5种药剂的敏感性极弱。

A，菌落；B，大型分生孢子；C和D，小型分生孢子。A， Colonies on PDA; B， Macroconidia; C and D， Microconidia.图2 芹菜茎基腐病病原菌形态Fig.2 Morphology of Fusarium oxysporum

图3 基于ITS和tef1的芹菜茎基腐病菌尖孢镰刀菌系统发育树Fig.3 Two-gene (ITS and tef1) phylogenetic tree of Fusarium oxysporum isolated from celery stalk basal rot

图4 黄心芹接种不同菌株发病情况Fig.4 The pathogenic test of Huangxin celery by different strains

在5个对芹菜茎基腐病菌有强抑制作用的杀菌剂中，除70%甲基硫菌灵WP外，其他4个药剂均为戊唑醇及其复配制剂，说明戊唑醇对该病菌具有较强的抑制作用。

2.4 田间药效试验

根据室内药剂筛选结果，结合当地菜农用药习惯，选择70%甲基硫菌灵WP和75%肟菌·戊唑醇WDG进行田间药效试验。田间药效试验结果(图7)表明，75%肟菌·戊唑醇WDG的2个处理(T3和T4)对芹菜茎基腐病的防效分别为82.6%和77.7%，移栽前浸根处理略好于未浸根处理，但无显著性差异。70%甲基硫菌灵WP的2个处理(T1和T2)对芹菜茎基腐病的防效分别为78.8%和55.9%，增加移栽前浸根处理的防效显著(P<0.05)高于未浸根处理。

图5 不同地块不同芹菜品种茎基腐病发病率调查Fig.5 Disease incidence investigation in typical field

图6 芹菜茎基腐病田间病情消长动态调查Fig.6 Celery stalk basal rot disease dynamics in field investigation

表2 二十九种常见杀菌剂对芹菜茎基腐病的抑制率

续表2 Continued Table 2

3 讨论

在生产实践中，芹菜茎基腐病发生严重，严重影响产业健康持续发展。芹菜茎基腐病主要发生在芹菜近地面的根茎部和叶柄基部，发病初期病部呈灰褐色，扩展后变成暗绿色至黑褐色，严重时受害部位变黑腐烂。病原菌分离鉴定和致病性测定表明，尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum为芹菜茎基腐病的病原菌。芹菜茎基腐病在连作条件下发病重，可能病原菌随着病残体进入土壤，造成土壤菌源积累，从而导致芹菜茎基腐病发病越来越重。因此，对该病的防控首先应从栽培管理出发，提倡轮作，特别是水旱轮作，减少土壤菌源积累。

不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。The bars without the same letters showed the significant difference (P<0.05).图7 田间药剂试验结果Fig.7 The control effect of fungicides in field

应用杀菌剂是植物病害防治的重要手段。镰刀菌是一种重要的土传病原真菌，且因为存在不同专化型，不同杀菌剂对镰刀菌的毒力差异显著。本研究对芹菜茎基腐病菌尖孢镰刀菌的室内药剂筛选结果表明，430 g·L-1戊唑醇SC、40%丙硫菌唑·戊唑醇SC、70%甲基硫菌灵WP、30%唑醚·戊唑醇SC、20%氰烯·己唑醇SC、75%肟菌·戊唑醇WDG、40%氟菌唑WP、125 g·L-1氟环唑SC和35%氟菌·戊唑醇SC按田间推荐使用浓度再稀释50倍后，仍对芹菜茎基腐病菌的菌丝生长有较强抑制。潘龙其等[6]室内毒力测定表明，紫花苜蓿根腐病菌拟枝孢镰刀菌对咯菌腈、戊唑醇、丙环唑和多菌灵较敏感， EC50分别为0.04、0.26、0.47和0.61 mg·L-1，但对嘧菌酯和恶霉灵的敏感性较差，EC50分别为42.91和53.64 mg·L-1。田间药效试验表明，250 g·hm-2的50%咯菌腈和43%戊唑醇对紫花苜蓿根腐病的防效分别为69.42%和66.78%[6]。刘铭等[7]研究表明，辣椒枯萎病菌尖孢镰刀菌对氟硅唑、多菌灵、甲基硫菌灵较敏感，EC50分别为0.05、0.16和1.36 mg·L-1。肖荣凤等[8]在2020年研究提出， 6.6%嘧菌酯·1.1%咯菌腈·3.3%精甲霜灵FS和25%吡唑醚菌酯SC稀释至2 000倍液，对太子参根腐病病原尖孢镰刀菌的抑制率分别为78.52%和75.36%。王芳等[9]在2019年研究提出，药后72 h，杀菌剂丙环唑对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的抑制效果最佳，EC50值为0.903 9 mg·L-1。已有文献资料表明，戊唑醇[10]、甲基硫菌灵、嘧菌酯等杀菌剂对镰刀菌有良好抑制作用，与本研究所筛选得到的结果类似。同时，本研究田间药效试验表明，75%肟菌·戊唑醇WDG和70%甲基硫菌灵WP对芹菜茎基腐病菌均有较好防效。从减少农药使用量和节本省工的角度，优先推荐选用75%肟菌·戊唑醇WDG在芹菜幼苗移栽缓苗后及封行前各粗喷雾1次，70%甲基硫菌灵WP可作为防控芹菜茎基腐病的合理轮用药剂，在芹菜幼苗移栽时浸根处理，并在移栽缓苗后和封行前各粗喷雾1次。