芍药花茎强度与褪黑素含量的关系分析

石文波，高天翔，胡蕴钰，许 聪，陶 俊，赵大球

(扬州大学 园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009)

褪黑素(melatonin， MT)是一种吲哚类小分子，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)。自1958年首次由牛的松果体组织中分离提取之后，褪黑素目前已在细菌、真菌以及各种动植物中均被发现[1]。与动物相比，植物上褪黑素研究起步较晚，直到1995年Dubbels等[2]和Hattori等[3]才在单子叶与双子叶植物中发现了褪黑素的存在。由于结构上和生长素具有高度相似性以及具有清除自由基的能力[4-5]，褪黑素往往被认为是一种全新的植物生长调节剂和生长刺激剂，发挥着广泛的生理作用，其中最主要的是调节植物生长发育[6]和增强植株抗逆性[7]。目前，褪黑素已在大田农作物、园艺植物上广泛应用[8-9]，而在观赏花卉上涉及较少。

芍药(PaeonialactifloraPall.)是原产于我国的传统名花，其栽培历史超过4 000年，远在夏代就在宫廷中用于观赏[10]。由于芍药花大色艳、花型端庄、花香袭人，且正常花期又在5月，常被欧美国家作为婚礼鲜花使用，现已成为国际市场上广受青睐的高档切花[11]。根据我国行业标准，花茎挺直程度是衡量芍药切花品质最基本的也是最重要的品质指标[12]。而我们在生产中发现，大量花色、花型表现优异的品种却在花茎品质上表现欠佳，容易弯曲、倒伏，挺直程度差。而在物理学上，植物的茎秆强度可作为植物茎秆挺直程度的衡量标准[13]。本课题组前期围绕芍药花茎挺直程度的问题，通过对芍药不同发育时期花茎的形态、解剖结构和细胞壁组分含量进行观测，明确了花茎强度是由其组织中加厚的次生细胞壁来控制，木质素是影响芍药花茎强度的主要细胞壁组分[14]。此外，硅、钙等矿质元素处理均能显著增强芍药花茎强度，提高木质素含量[15-16]。

近期研究发现，外源喷施褪黑素能够显著增强陆地棉茎秆中木质素含量，从而提高了植株对黄萎病抗性[17]。而在芍药上，褪黑素是否能够通过调控木质素的合成来影响芍药花茎强度至今未见报道。本研究选择10个不同花茎挺直程度的芍药品种为材料，测定花茎机械强度、植株形态指标、植株光合特性、花茎木质素与褪黑素含量，旨在明确花茎强度与褪黑素含量的关系，为后期芍药切花茎秆品质的改良奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

基于本课题组前期关于芍药花茎机械强度聚类分析结果[18]，选用栽植于扬州大学国家芍药种质资源库中的花茎强度低的芍药品种玫瑰紫、粉珠盘、桃花飞雪、春晓、紫花剪绒和花茎强度高的芍药品种山河红、雪原红花、紫袍、胜富贵、金辉为材料，在盛花期测定完植株高度、光合特性后，将剪取的植株迅速带回实验室，而后剪取花朵以下12 cm茎秆测定相关形态指标，并置于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 花茎强度测定

采用茎秆强度测定仪(NK-2，杭州汇尔仪器设备有限公司)测定花茎强度，每个品种测定10支。

1.2.2 植株形态指标测定

株高由米尺在田间测定，采用游标卡尺(X-2， 深圳量天下计量仪器有限公司)和天平(T500，常熟双杰测试仪器厂)分别测定花径、花质量、茎粗和茎质量，相关指标测定以花蕾以下12 cm花茎为对象，每个品种测定10支。

1.2.3 植株光合特性测定

利用便携式光合仪(LI-6400，美国Li-Cor)于当地时间上午8:30进行测定，叶片选取芍药顶端向下第四节处。数值稳定后通过系统记录净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、细胞间CO2浓度(Ci)和气孔导度(Gs)4个光合参数。

1.2.4 花茎木质素含量测定

花茎木质素含量采用试剂盒进行测定(苏州科铭生物技术有限公司)。先将样品 80 ℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛获取干样。称取5 mg干样(记为W)于10 mL试管中，对照管不加。然后加入1 000 μL试剂一和40 μL高氯酸，用封口膜密封，充分混匀，80 ℃水浴40 min，每隔10 min振荡一次，然后自然冷却。加入1 000 μL试剂二，充分混匀。取上清液40 μL加入1 960 μL试剂三。取1 mL于微量比色皿中，使用紫外分光光度计(Alpha1502，上海谱元仪器有限公司)测定280 nm处吸光值D。分别记为D空白管和D测定管。ΔD=D测定管-D空白管。木质素含量(mg·g-1，以干重计)=0.029 4×(ΔD-0.006 8)÷W×50。

1.2.5 花茎褪黑素含量测定

花茎褪黑素含量采用植物褪黑素试剂盒进行测定(上海桥杜生物科技有限公司)。将芍药茎秆加液氮用研钵研磨均匀，称取0.1 g样品冻干粉，置于1.5 mL离心管中，加入1 mL磷酸缓冲溶液，摇晃均匀。将样品置于冰上，使用超声波细胞破碎仪100 W，超声30 s，随后样品匀浆在4 ℃下10 000 ×g离心10 min，取上清备用。先将试剂盒室温平衡20 min，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加入50 μL不同浓度的标准品，标准品浓度分别为0、50、100、200、400、800 pg·mL-1。样品孔中先加10 μL待测样本上清，再加入40 μL样品稀释液(10倍稀释)。然后标准品孔和样品孔中均加入100 μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，重复洗板5次。而后每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。孵育后每孔加入50 μL终止液，而后放入酶标仪(SpectraMax M5，美国Molecular Devices)中，在450 nm波长处测定各孔的D值，15 min内测定。利用测得标准曲线计算褪黑素含量。

1.2.6 数据统计分析

数据以平均值±标准差表示，数据整理采用Excel 2016软件完成，图片采用Sigma Plot 10.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 花茎强度

本研究选取了10个芍药品种为材料，从图1可以看出，芍药品种玫瑰紫、粉珠盘、桃花飞雪、春晓和紫花剪绒的花茎显著弯曲，花朵下垂，而芍药品种山河红、雪原红花、紫袍、胜富贵和金辉的花茎挺直。

通过对花茎强度进行测定，发现花茎弯曲的芍药品种花茎强度平均值为10.14 N，花茎挺直的芍药品种花茎强度平均值为18.33 N(图2)。其中，胜富贵的花茎强度最高，达到19.88 N，为花茎强度最低品种紫花剪绒的2.26倍。

2.2 植株形态指标

在对不同花茎强度芍药品种的株高、茎粗、茎质量、花质量和花径等植株形态指标进行测定后发现，高花茎强度芍药品种的茎粗与茎质量均高于低花茎强度芍药品种，尤其是茎粗，前者的均值超出后者36.3%；而株高、花径和花质量等指标在不同芍药品种间表现不一，高花茎强度芍药品种虽然大部分高于低花茎强度品种，但差异不明显(表1)。

图1 不同花茎强度芍药品种的花茎形态Fig.1 Morphology of inflorescence stems in P. lactiflora cultivars with different inflorescence stem strength

图2 不同芍药品种的花茎强度Fig.2 Inflorescence stem strength of P. lactiflora cultivars

2.3 植株光合特性

不同花茎强度芍药品种的植株光合特性也存在差异(图3)。高花茎强度芍药品种的Pn、Gs和Tr均高于低花茎强度芍药品种，尤其是花茎强度最高品种胜富贵的3个光合参数均最高。而就Ci值而言，除金辉外，高花茎强度芍药品种同样高于低花茎强度芍药品种。

2.4 花茎木质素含量

木质素是影响芍药花茎强度的主要细胞壁组分[14]。本研究采用紫外分光法对不同花茎强度芍药品种的花茎木质素含量进行测定，发现高花茎强度芍药品种的花茎木质素含量均高于低花茎强度芍药品种(图4)。低花茎强度芍药品种的平均花茎木质素含量为91.96 mg·g-1，而高花茎强度芍药品种的平均花茎木质素含量则为109.98 mg·g-1，它比低花茎强度芍药品种高出了19.6%。在这10个品种中，胜富贵的花茎木质素含量最高，达到121.48 mg·g-1，而紫花剪绒的花茎木质素含量最低，仅为87.9 mg·g-1。

2.5 花茎褪黑素含量

本研究又采用酶联免疫法对不同花茎强度芍药品种的花茎褪黑素含量进行了测定，其变化与花茎木质素含量基本一致，高花茎强度芍药品种的花茎褪黑素含量均高于低花茎强度芍药品种(图5)。低花茎强度芍药品种的平均花茎褪黑素含量为776.67 pg·g-1，而高花茎强度芍药品种的平均花茎褪黑素含量仅为1 179.45 pg·g-1，它比低花茎强度芍药品种高出了45.7%。在这10个品种中，胜富贵的花茎褪黑素含量依然最高，达到1 449.67 pg·g-1，而桃花飞雪的花茎褪黑素含量最低，仅为607.57 pg·g-1。

随后，将花茎强度、花茎木质素含量、花茎褪黑素含量3者之间的相关性进行了进一步分析，发现花茎强度与花茎木质素含量之间的相关性系数为0.87，达到显著水平；花茎强度与花茎褪黑素含量之间的相关性系数为0.71；而花茎木质素含量与花茎褪黑素含量之间的相关性系数为0.81，同样达到显著水平。

表1 不同花茎强度芍药品种的形态指标

图3 不同花茎强度芍药品种的光合特性Fig.3 Photosynthetic characteristics of P. lactiflora cultivars with different inflorescence stem strength

图4 不同花茎强度芍药品种的木质素含量Fig.4 Lignin content of P. lactiflora cultivars with different inflorescence stem strength

图5 不同花茎强度芍药品种的褪黑素含量Fig.5 Melatonin content of P. lactiflora cultivars with different inflorescence stem strength

3 讨论

作为植物体三大营养器官之一，茎不仅能够为整个植物体协调养分、水分的输导，还起着机械支撑的重要作用[19]。茎秆强度与植株形态特征之间存在显著的相关性，尤其是茎粗和株高。一般来说，茎粗与茎秆强度之间呈显著正相关，而株高在不同植物间则表现不一，这在农作物的抗倒伏育种中已经得到广泛的研究[20-21]。在观赏植物向日葵上的研究同样显示，茎粗是影响茎秆强度的主要形态指标[22]。在本研究中，我们发现高花茎强度芍药品种的茎粗与茎质量均显著高于低花茎强度品种，这与前人的研究相一致[18]。茎粗是次生细胞壁厚度的外在体现，茎质量则代表着茎秆中贮藏物质的含量，高花茎强度芍药品种具有较高的茎粗与茎质量表明芍药花茎的微观结构与物质组成对其强度具有重要影响。此外，芍药株高、花质量与花径虽然与花茎强度也呈正相关，但均未达到显著水平，表明随着芍药花质量与花径的增加，可能诱导了花茎提供更高的强度来支撑花朵，但这不是花茎变强的主要原因。

植物茎秆的化学构成，特别是细胞壁组分及其含量与茎秆强度之间有着紧密联系。植物细胞壁由纤维素、半纤维素、木质素、果胶、多糖和蛋白质组成，是一个强大的纤维网络，为细胞、组织和整个植物提供机械支持[23]。在这些组分中，木质素通过渗透到纤维素结构之间的空隙中，不仅对维管植物的水分运输和防御病原体起着至关重要的作用，而且有利于增强细胞壁的强度，赋予植物茎秆刚性[24]。大量针对大田作物的研究表明，较高的木质素含量是茎秆抗倒伏性的基础，抑制木质素的合成往往会显著降低植株的茎秆强度，使其倒伏率明显上升[25-26]。在观赏花卉非洲菊上，Perik等[27]也发现较高的木质素含量使非洲菊在瓶插时不易弯曲，拥有更长的观赏期。在本研究中，高花茎强度芍药品种的花茎木质素含量显著高于低花茎强度品种，木质素含量与茎秆强度之间呈显著正相关，这与我们前期的研究结果相一致[16]。光合作用是植物获得碳水化合物的源泉[28]。植物茎秆碳水化合物的积累与运转受叶片光合能力影响，而充足的碳水化合物为木质素的合成提供了碳源，经过木质素代谢途径最终聚合成木质素，最终决定了植物茎秆的强度[29-30]。如刘婷[31]对大豆的遮阴胁迫中发现光合能力的降低使得大豆茎秆中碳水化合物蔗糖及木糖含量均显著减少，最终降低了茎秆中木质素含量，抗折力也显著减弱。在本研究中，我们同样发现高花茎强度芍药品种的光合参数Pn、Tr、Ci、Gs均明显高于低花茎强度品种，拥有更强的光合能力，这可能是高花茎强度芍药品种茎秆具有更高的木质素含量的碳源基础。

近年来，关于褪黑素的报道越来越多，人们认为植物体从色氨酸代谢到褪黑素一般需要经过4个连续的酶促反应，涉及的4个酶分别为色氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase， TDC， EC 4.1.1.28)、色胺-5-羟化酶(tryptamine 5-hydroxylase， T5H， EC 1.1.13、血清素氮-乙酰转移酶(serotonin nacetyltransferase， SNAT， EC 2.3.1.87)和咖啡酸-氧-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase， COMT， EC2.1.1.68)[32-33]。其中COMT在木质素特异代谢途径中也起着重要的作用，Byeon等[34]推测植物体内木质素和褪黑素之间存在拮抗或者协同的关系。现有研究发现，在不同的植物上褪黑素对于植物体内木质素合成调控效应不同，如在陆地棉上其上调了木质素合成[17]，而在竹笋与猕猴桃上则产生了抑制作用[35-36]。本实验中，我们发现高花茎强度芍药品种花茎中褪黑素含量均高于低花茎强度品种，同时褪黑素含量与木质素含量呈显著正相关，这表明芍药花茎褪黑素和木质素可能存在协同作用。此外，大量研究表明，褪黑素能够保护叶片叶绿体，促进光合作用，增加光合碳化效率[37-38]，这揭示了高花茎强度芍药茎秆中较高的褪黑素含量还可能导致其具有更高的光合能力，从而促进茎秆中木质素的合成与积累，最终获得更高的花茎强度。