MUC5B启动子rs35705950、rs868903基因多态性与特发性肺纤维化的相关性研究

宋永娜 王林纳 翟建霞 董润 祖翡翠 焦晓琪 陈秋生

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种以肺泡结构紊乱、弥漫性肺泡炎及肺纤维化为主要病理特征的疾病[1]。该病起病隐袭，早期诊断困难，治疗上除肺移植外无其他有效方法，因此预后极差[1-3]。IPF的中位生存期仅为3年，死亡率甚至与许多终末期恶性肿瘤的死亡率相当[3-5]。随着IPF 研究的深入，国外关于IPF早期诊断的相关基因研究逐渐成为热点[1]。目前研究发现，人粘蛋白5B(mucin-5 subtype B，MUC5B)启动子的多态性与IPF的发生、发展及预后具有一定相关性，而目前此类研究主要集中于白种人，在国内的相关研究较少[6-7]。因此，本研究通过病例对照研究，探讨MUC5B rs35705950和rs868903两个位点的基因多态性与IPF发病风险之间的相关性，以便早期发现易感人群、协助判断患者预后及为治疗提供新思路。

资料与方法

一、资料收集

按照ATS/ERS/JRS/ALAT联合颁布的最新IPF诊断及治疗国际性循证指南[5,8]，选取2014年1月至2018年12月于我院确诊的IPF患者114例作为病例组(已排除继发性肺纤维化、恶性肿瘤、急性感染、严重心血管疾病、糖尿病肾病及结核病)。另随机选择我院同期健康体检者100例为对照组。收集两组患者的相关临床资料(年龄、性别、吸烟史、家族史等)。这项研究已通过本院的伦理委员会批准，所有参与者均签署知情同意书。

二、方法

1 DNA样本的提取 所有研究对象均于清晨空腹状态下采集外周静脉血2 mL于EDTA-K2抗凝管中，采用血液DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)提取DNA，操作严格按说明书进行。

2 引物设计 引物序列设计参照相关文献[3,5]：MUC5B rs35705950引物序列上游：5′-AACCGGCGTGTTCCCTTTCCTTCCT-3′，下游：5′-GACTTGTCGTCCCT CCCACTA-3′；MUC5B rs868903引物序列上游：5′-TGCAACACCAGCTCACCAT-3′，下游：5′-TGTCCAC AGCAGCATCACT-3′。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。

3 DNA扩增 PCR扩增反应体系20 μL，含基因组DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5 μL，4×dNTP 0.5 μL以及Taq聚合酶0.2 μL。反应条件：95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性45 s，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，35个循环后72 ℃继续延伸7 min。

4 基因测序 分别检测MUC5B rs35705950和MUC5B rs868903的单核苷酸多态性。PCR产物测序由北京康旭医学检验所完成。

5 随访方式 采用患者复诊与电话沟通相结合的方式进行随访。随访截止日期为2020年5月31日。总生存率(overall survival rate，OS)定义为首次确诊为IPF至患者死亡或至随访截止时间。

三、统计学分析

结 果

一、两组研究对象的一般资料比较

本研究共纳入IPF确诊病例114例，同期健康体检者100例。两组研究对象均无IPF家族史，且两组对象在年龄、性别、吸烟史、BMI指数等方面均无显著差异(P>0.05)，具有可比性(见表1)。

表1 两组研究对象的一般资料比较[n(%)]

二、遗传平衡性检验

根据表2可知，两组研究对象的MUC5B rs35705950和MUC5B rs868903基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡性检验(P>0.05)，显示所研究的样本具有群体代表性(见表2)。

表2 Hardy-Weinberg遗传平衡性检验

三、两组研究对象MUC5B rs35705950不同基因型和等位基因分布

由表3可知，病例组中GT+TT基因型和T等位基因的频率显著高于对照组(P=0.015，P=0.007)。采用二元Logistic回归分析进行基因多态性的比较发现，携带突变基因型GT或TT者较野生基因型GG者患IPF的OR为2.511，95%CI为(1.173-5.373)；携带T等位基因者较G等位基因者患IPF的OR为2.603，95%CI为(1.268-5.343)。

四、两组研究对象MUC5B rs868903不同基因型和等位基因分布

由表4可知，病例组中CT+CC基因型和C等位基因的频率显著高于对照组(P=0.033，P=0.045)。采用二元Logistic回归分析进行基因多态性的比较发现，携带突变基因型CT或CC者较野生基因型TT者患IPF的OR为1.968，95%CI为(1.051-3.683)；携带C等位基因者较T等位基因者患IPF的OR为1.477，95%CI为(1.008-2.165)。

表3 两组研究对象MUC5B rs35705950不同基因型和等位基因分布

表4 两组研究对象MUC5B rs868903不同基因型和等位基因分布

五、MUC5B rs3570595和rs868903基因多态性与IPF患者生存状况的关系

本研究共随访到106例患者，8例缺失，随访率92.98%。106例患者中死亡32例(30.19%, 95%CI：21.45%-38.93%)，平均总生存期(OS)为26.08个月。根据图1A、B示，MUC5B rs3570595的GT和TT基因型患者的OS显著低于GG患者(χ2=3.971，P=0.046)；而MUC5B rs868903的CT和CC基因型患者与TT患者的OS之间差异无统计学意义(χ2=0.650，P=0.420)(见图1A、1B)。

图1A MUC5B rs35705950基因多态性与IPF患者生存状况的关系

图1B MUC5B rs868903基因多态性与IPF患者生存状况的关系

讨 论

特发性肺纤维化(IPF)是一种病因不明、慢性、进行性致纤维化的间质性肺炎[1,9]。据报道，IPF的发病率约为6.8～16.3人/10万人，且发病率逐年增高[10]。而IPF患者对药物治疗反应小，预后极差，严重威胁人类的生存健康[3,11]。因此，IPF的发病机制成为目前研究的热点。现研究认为遗传基因在IPF的发病过程中起到了重要作用，其中MUC5B启动子的单核苷酸多态性引起人们的广泛关注[5,10]。MUC5B是一种分泌蛋白，主要是由呼吸道远端气道黏膜下黏液腺细胞所产生，主要影响气道黏液的流变特性和气道防御功能等[9,10]。研究发现，MUC5B 启动子的多态性不仅可作为 IPF 易感性的指标，也可以反映 IPF 的预后[9,10]。然而目前这些研究主要集中在西方国家的患者，关于东亚人口的相关数据仍然有限。因此，明确我国人群IPF的易感基因，对IPF患者早期诊断、治疗及预后判断具有重要意义。

Seibold等[9,12]早在2011年就发现MUC5B转录起始点上游rs35705950 基因多态性与IPF的发病具有较强的相关性。之后Borie等[13]进行一项前瞻性队列研究发现，MUC5B启动子rs35705950多态性与IPF相关，但与硬皮病所引起的间质性肺疾病不相关，提示两者具有不同的病理生理。国内Wang等[14]的一项针对我国汉族人群的MUC5B启动子rs35705950多态性分析显示，IPF患者T等位基因的频率高于健康人群，表明该变异与我国汉族IPF患者遗传易感性相关。而苟安栓等[15]对88例维吾尔族IPF患者MUC5B启动子rs35705950多态性分析，并未发现基因型构成与等位基因之间差异存在统计学意义。本研究人群同样为汉族人群，结果示IPF患者GT+TT基因型和T等位基因的频率显著高于健康对照组，且携带T等位基因者对IPF的易感风险是G等位基因者2.603倍，提示携带T等位基因可能是IPF的易感基因，这与Wang等人的研究结果相似。

Peljto等[16]研究认为MUC5B启动子rs35705950基因多态性虽然可以导致IPF的发病风险增高，但其携带者的死亡率反而较低。Allen等[17]研究亦发现基因型为GT或TT的IPF患者死亡风险显著低于GG患者，认为MUC5B rs35705950基因多态性与IPF患者死亡率减少相关。国内郭璐等[5]研究同样发现GT基因型较GG基因型的IPF患者具有更长的生存期，死亡人数显著低于GG组。而相反的是，国内Jiang等[9,18]研究发现MUC5B rs35705950基因多态性与IPF患者FVC、DLco下降相关，生存分析显示携带T等位基因的IPF患者总生存期较短。本研究发现MUC5B rs35705950 GT和TT基因型患者的平均总生存期显著低于GG患者，认为MUC5B rs35705950单核苷酸多态性与IPF患者的死亡率减低有一定关系，识别IPF患者此位点的基因多态性，对判断患者的预后具有一定的价值。

目前关于MUC5B启动子的另一个单核苷酸多态性rs868903的相关研究很少，我国Wang等[6]首次研究证明MUC5B rs868903基因多态性与高分辨率计算机断层扫描的蜂窝状混浊程度和IPF患者的死亡率相关。本研究发现IPF患者CT或CC基因型和C等位基因的频率显著高于健康人群，携带突变基因C者患IPF的风险是携带野生型基因T者的1.477倍，提示携带C等位基因可能是IPF的易感基因。但对MUC5B rs868903基因多态性与IPF患者死亡风险关系的研究中，我们未发现携带突变基因型与患者的预后相关，其在对患者预后的预测价值上仍需进一步研究。

综上所述，MUC5B rs3570595和 rs868903基因多态性可能是我国IPF患者的易感因素，其中MUC5B rs35705950基因多态性与IPF患者的死亡率减低有一定关系，而MUC5B rs868903基因多态性与IPF预后的关系尚需进一步研究。本研究是一个单中心研究，样本量尚小且种族单一，而IPF基因多态性可能存在人种、地区等差异，其与IPF发病风险及预后的关系仍要多中心、大样本量来进一步证实。