慢性乙肝合并肺结核患者外周血单个核细胞HBV pgRNA的表达与免疫功能的相关性

2021-04-27张志锋薛珉徐瑞芳张红云张曹庚

临床肺科杂志 2021年5期

张志锋薛珉徐瑞芳张红云张曹庚

我国是乙肝病毒(HBV)高感染国家，又是肺结核高负担国家，慢性乙肝(CHB)合并肺结核患者在临床上并不少见，此类患者病情复杂，治疗难度更大。流行病学研究显示，CHB合并肺结核行抗结核治疗肝功能损害的发生率约为30%～50%，严重者可诱发急性肝衰竭，严重影响抗痨治疗和病情进展[1]。目前，抗结核药物导致HBV再激活已形成广泛共识，HBV活跃复制诱导机体处于炎症状态，从而改变肝脏解毒功能并增加药物的肝脏毒性，进一步加重抗结核所致肝损伤[2-3]。近年来，有研究指出血清HBV RNA是被包裹的前基因组RNA(pgRNA)，以类似于HBV样病毒颗粒存在，且与cccDNA状态密切相关，对于CHB再复制、抗病毒治疗的疗效评估具有重要价值[4]。本研究拟通过检测CHB合并肺结核患者外周血HBV pgRNA的表达，分析其与免疫功能的相关性，现报告如下。

资料与方法

一、一般资料

选取2018年3月-2019年3月我院结核门诊新确诊的CHB合并肺结核患者，共40例。入组标准：①CHB诊断均符合中华医学会肝病学分会联合感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎诊断标准(2015年版)》[5]。②肺结核病诊断依据《肺结核诊断标准(WS 288—2017)》[6]：a.痰结核菌阳性；b.明显低热、盗汗、咳嗽、咯血等结核中毒症状； c.病理检测阳性或痰抗酸杆菌PCR检测阳性；d.胸部CT有典型的结核影像改变；e.抗结核治疗有效。具备以上第1项或2～5项中3项者可诊断为结核。③年龄18～60岁，肺结核均为首次确诊，既往未接受过抗结核治疗。排除标准：①合并存在艾滋病病毒感染、糖尿病、自身免疫性疾病者；②既往急性或亚急性肝衰竭病史者、或其他重要脏器功能衰竭病史者；③明确诊断为非结核分枝杆菌感染者。其中男26例，女14例；年龄38～60岁，平均(48.5±6.2)岁；CHB病程1～25年，平均(10.7±2.6)年。按照随机数字表法，将患者分为对照组(n=20)、治疗组(n=20)。两组年龄、性别、病程等比较，差异均无统计学意义(t/χ2=0.51,1.75, 0.25，P>0.05)。本研究符合《赫尔辛基宣言》，入选对象均签署知情同意书。

二、方法

对照组给予2HRZE/4HR 方案，即异烟肼(H，山西汾河制药有限公司，国药准字H14022402)0.4g/次、利福平(R，广东华南药业集团有限公司，国药准字H44020771)0.60g/次、吡嗪酰胺(Z，广东华南药业集团有限公司，国药准字H44020761)1.5 g/次、乙胺丁醇(广东华南药业集团有限公司，国药准字H44020758)0.75 g/次，总疗程6个月。治疗过程定期检测肝功能，当谷丙转氨酶(ALT)指标升高时口服甘草酸二铵0.15g护肝治疗，持续到治疗全部结束。观察组在此基础上定期给予拉米夫定进行预防性抗病毒治疗，100 mg/次，1次/天，连续治疗6个月。

三、观察指标

1 标本采集:分别于治疗2、6个月后采集适量清晨空腹肘静脉血，肝素抗凝，送实验室备检。

2 HBV DNA、HBV RNA定量检测:取2 mL肝素抗凝静脉血，按常规方法用淋巴细胞分离液分离出外周血单核细胞(PBMCs)，与乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒(湖南圣湘生物科技有限公司)充分混合、裂解，分别提取PBMCs中HBV DNA、HBV RNA，采用ABI 7000实时免疫荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行PCR、RT-PCR。试剂盒检测下限为200 copies/mL。

四、统计学方法

结果

一、两组不同时间PBMCs中HBV DNA、HBV RNA比较

治疗前，两组PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后2个月，两组PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平较治疗前显著升高，治疗组治疗后6个月PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平较治疗后2个月显著下降，与治疗前比较均无显著性差异(P>0.05)，且均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

二、两组不同时间T淋巴细胞、IFN-γ水平比较

表1 两组不同时间PBMCs中HBV DNA、HBV RNA比较 log copies/mL)

表2 两组不同时间T淋巴细胞、IFN-γ水平比较

三、HBV DNA、HBV RNA与免疫功能指标的相关性

表3 PBMCs中HBV DNA、HBV RNA与免疫功能指标的相关性

讨论

目前，肺结核的临床治疗方案已经较为成熟，但对肺结核合并CHB患者如何在确保治疗效果同时减轻对肝功能的损害，一直是该领域临床医生关注的热点问题[7]。HBV再激活是指HBV病毒携带者在接受细胞毒性药物或免疫抑制剂等治疗后HBV复制力增强，是继发药物性肝损害主要原因之一，其发生机制复杂，化疗、免疫抑制剂可直接或间接促进HBV复制，但对于抗结核治疗过程中出现的HBV再激活尚缺乏足够证据[8]。研究表明，PBMCs作为免疫细胞，其感染HBV可能与CHB病情反复加重或某些病理条件作用有关，被视为HBV再激活的基础[1]。

近年来研究表明，ccc DNA为模板反转录合成RNA是病毒复制的开端，也是反复感染的关键因素，彻底清除ccc DNA才能治愈CHB，但ccc DNA检测侵入性的局限性极大限制其发展与应用[9]。PBMCs中HBV RNA主要为pg RNA，其来源可能为HBV复制过程中核衣壳包裹的pg RNA未进行逆转录时获得包膜并从感染的肝细胞中释放入血，被称为HBV RNA病毒样颗粒，可以反映cccDNA水平及转录活性，可作为指导抗病毒治疗及安全停药的一个生物标志物[10-11]。根据临床经验，HBV治疗1个月可开始激活，1.5～2个月达到高峰，因此治疗后2个月检测能够有效反映病毒再激活现象。本研究结果显示，两组抗结核治疗后2个月PBMCs中HBV DNA、HBV RNA表达较治疗前显著升高，提示该时期HBV出现大量复制、再激活，而治疗组治疗后6个月PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平明显回落，恢复至治疗前水平，且显著低于对照组(P<0.05)，说明预防性应用抗病毒治疗有助于抑制HBV再激活，降低HBV pgRNA载量，进而降低抗结核治疗过程的肝损伤[12]。