miR-378 促进脂质生成相关靶基因鉴定

张廷焕 龙熙 郭宗义 柴捷

（1. 重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2. 农业部养猪科学重点实验室，重庆 402460）

microRNAs（miRNAs）是一种内源性的的非编码RNA，包含20-24 个核苷酸。目前miRNAs在各类组织或细胞中具有至关重要的生物学意义，miRNAs 主要是借助特异性位点（种子序列）与靶基因mRNA 3'UTR 区的靶位点相结合，发挥降解mRNA 或抑制翻译的作用［1］。其中，miR-378 通过靶基因调控着多种重要的生理学和病理学过程，包括肌生成［2］、成骨分化［3］以及癌症发生［4］等。例如，miR-378 特异性结合MyoR［2］、BMP2［5］、IGF1R［6］和caspase-3［7］等靶基因，参与了骨骼肌的发育；miR-378 可以靶向与p110α结合，调控肝脏胰岛素信号，继而起到调节葡萄糖和脂类稳态的作用［8］；miR-378 定向调控MED13 的表达进而实现线粒体代谢及其系统能量代谢的平衡［9］。miR-378 还能与GalNT-7相结合，控制肾联蛋白的表达量，从而调控成骨分化过程［10］。

目前已经有很多生物信息学软件和计算程序可用于预测miRNAs 的靶基因，但除了双荧光素报告基因实验能证明miRNAs 与靶基因的mRNAs 直接结合外，其他有效的实验手段非常有限。近年来，microRNA pulldown 技术的兴起，极大地加快了miRNAs 的研究进展。microRNA pulldown 技术主要是利用生物素标记的miRNAs 转染细胞，再利用链霉素与生物素的亲和性将结合了靶基因的miRNAs复合体分离出来，然后用RT-PCR 或RNA-seq 等手段方法高效地对靶基因mRNA 进行富集分析。在癌症抑制因子miR-31 调控肝癌细胞发生的机制研究中，miR-31 pulldown 实验成功发现了miR-31 与细胞周期蛋白的靶向关系，miR-31 能够调控细胞周期蛋白的降解从而抑制肝癌细胞的发生［11］。而在miR-1827 的研究中，microRNA pulldown 成功找到miR-1827 与MDM2基因的靶标关系，从而影响癌基因P53的表达进而调控癌症的发生［12］。microRNA pulldown 技术在miRNAs 靶标鉴别领域具有广泛的应用前景，将益于高效，精准地鉴别miRNAs 的靶标关系，同样也为深入探索miRNAs 功能及其作用机制提供了强有力的技术支撑。目前已有大量研究证实除了miRNAs 种子序列和靶基因mRNA 3'UTR的经典作用机制外，miRNAs 还具备多种非经典的调控方式［13-14］，microRNA pulldown 为这些研究提供了强有力的技术支撑。

本课题组前期研究发现miR-378 除了在心脏、肌肉有高表达外，在皮下脂肪也有较高的表达丰度［15］。本实验将miR-378 类似物转染至3T3-L1 细胞，探索miR-378 在脂肪细胞中的功能；根据靶标位点的保守性以及促脂功能确定miR-378 潜在靶基因；采用生物素标记的miR-378 进行pulldown 实验，利用RT-PCR 对候选靶基因进行富集分析，从而验证靶标关系；再构建miR-378 靶位点报告基因载体，利用双荧光素报告基因实验确定靶标位点。本实验旨在为进一步研究miR-378 在脂肪生成中功能奠定基础，同时也为microRNA pulldown 技术在miRNAs靶标验证中的可靠性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠的前体脂肪细胞（3T3-L1）、人胚胎肾细胞（HEK293）购自北京协和细胞资源中心。试剂大肠杆菌感受态细胞TOP10 购自康为世纪生物科技有限公司，载体质粒psiCHECK-2 购自Promega 公司；DNA 提取试剂盒、RNA 提取试剂盒、Q5 超保真DNA 聚合酶和内切酶均购自NEB 公司；蛋白酶K、GoTaq®qPCR Master Mix 和双荧光素酶报告基因系统试剂盒来自Promega公司；PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒来自Omega 公司；干扰RNA 购自Ribobio 公司；Lipofectamine 2000 购自Invitrogen 公司；琼脂糖、DNA marker 购自TaKaRa 公司；miRNA 类似物以及生物素（Bi）标记的miRNA 均由锐博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 油红O 染色定量 本实验合成了两种不同miRNA 类似物，分别为实验组miR-378 和对照组Control，其中Control 为无义序列，每组设置3 个重复孔。将这两种miRNA 类似物分别转染到3T3-L1细胞，当细胞在6 或12 孔板中分化培养到第8 天，用PBS（含10%福尔马林）在室温下固定1 h，再用蒸馏水冲洗孔板3 次。用含0.5%油红O 染色1 h，之后用异丙醇或PBS 清洗，即可在显微镜下观察。之后，用异丙醇溶解脂滴，在酶标仪上检测550 nm吸光度值，其中脂肪分化程度和油滴大小与吸光度成正相关。

1.2.2 miRNA-378 候选靶基因筛选 本实验利用在 线 软 件Targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）预测miR-378 的靶基因，然后根据结合位点在物种间保守和在脂肪细胞中的功能确定3 个候选靶基因Runx1t1、Galnt3、RAB10和1 个阴性对照基因GDF6。

1.2.3 miRNA-378 的pulldown 实验 本实验合成了两种不同的生物素（Bi）标记的miRNA，即实验组Bi-miR378 和对照组Bi-control，其中Bi-control 为无义序列，每组设置3 个重复孔。将两种miRNA 分别转入HEK293 细胞中，培养48 h，miRNA 在细胞内与靶基因mRNA 相结合，裂解细胞将二者结合物释放出来，加入磁珠使其与生物素标记miRNA 进行结合，利用磁力架将复合物（磁珠、Bi-miRNA 和mRNA）捕获下来，再对复合物进行清洗、洗脱释放mRNA，随后利用反转录和RT-PCR 检测GDF6、Runx1t1、Galnt3、和RAB10四个靶基因的mRNA 富集程度，10 μL 反应体系：GoTaq@qPCR Master Mix（2×）5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.2 μL，CXR 0.1 μL，cDNA 1 μL，ddH20 3.5 μL。反应程序：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40 个循环，采用2-△△Ct方法计算基因表达量。RT-PCR 所用引物如表1。

表1 RT-PCR 扩增引物

1.2.4 miR-378 靶位点报告基因构建 从Ensembl 数据库（https：//www.ensembl.org）中下载小鼠GDF6、Runx1t1、Galnt3和RAB10基因的3'UTR 区中靶位点附近约400 bp 的序列，再利用引物设计软件Primer 5.0 获得了4 对扩增引物（表2），然后在每对引物上游5'端和下游3'端分别添加XhoI 酶切位点和NotI 酶切位点序列。通过PCR 获得目的片段，再将其和骨架载体psiCHECK-2 进行酶切、连接等步骤，生成含有靶位点的报告基因载体，再将报告基因测序验证其正确性。

1.2.5 荧光素酶活性测定 将4 个报告基因载体分别和两种不同miRNA（实验组miR-378 和对照组control）类似物两两组合转染HEK293 细胞，每种组合转染3 个孔作为生物学重复，培养48 h 后裂解细胞。采用双荧光素酶活性检测试剂盒和化学发光检测仪来测量，获得萤火虫荧光素酶发光值和海肾荧光素酶发光值。然后利用萤火虫荧光素酶发光值除以海肾荧光素酶发光值得到每种组合的相对荧光值。再对比每个报告基因载体的实验组（miR-378）和对照组（Control）的相对荧光值之间的变化情况，来判定该基因是否和miRNA-378 有靶标关系。

1.2.6 统计分析 使用Excel2013 进行试验数据整理，用SPSS 19 软件中的Student’st-test 进行差异显著分析，使用Publisher2013 作图。

表2 PCR 扩增引物

2 结果

2.1 miR-378促进脂肪细胞脂质生成

为了确定miR-378 在脂肪细胞中的功能，本实验合成了miR-378 类似物，将其转染到3T3-L1 前体脂肪细胞，诱导分化8 d 后，利用油红O 进行了脂滴染色分析，结果显示与Control 组的脂肪细胞相比，miR-378 组的脂滴出现了明显的增加（图1-A）。通过酶标仪检测550 nm 吸光度值，对脂滴含量进行定量分析，miR-378 组的吸光值有显著的上升，约为Control 组的1.6 倍，与细胞表型结果完全一致（图1-B），这说明miR-378 刺激了脂肪细胞中脂质的生成。随后，本实验通过RT-PCR 检测两组实验中与脂质相关基因的表达情况，与Control 组相比，在miR-378 组中与脂质合成相关基因PGC-1α和PPAR-γ表达量显著上升，而与脂质分解相关基因ATGL和CGI-58的表达量有显著的下降（图2）。以上结果说明miR-378 通过增加脂质合成和减少脂质分解两条途经来促进脂肪细胞中脂质的积累。

2.2 microRNA pulldown验证miR-378的靶标关系

为了探索miR-378 在调控脂肪生成中相关的靶基因，本试验通过筛选靶标结合位点在物种间是否保守和靶基因是否被报道参与了脂肪细胞生理功能，最终确定了3 个候选靶基因Runx1t1、Galnt3和RAB10。其中，RAB103 'UTR 与miR-378 种子序列2-8 位相结合，Runx1t1、Galnt3的3 'UTR 与其种子序列2-7 位结合，所有的结合位点在人、鼠、黑猩猩等5 个物种间都保守（图3），其中，Runx1t1参与了脂肪细胞的分化而Galnt3和RAB10与脂肪细胞能量代谢相关。由于GDF63'UTR 区不包含miR-378的靶位点，作为阴性对照。

本实验采用microRNA pulldown 技术对这4 个靶标关系进行快速验证，用生物素标记的miR-378（Bi-miR378）转染到HEK293 细胞内，然后捕获到与miR-378 结合的mRNA，再通过反转录、RT-PCR验证靶基因的富集情况。结果发现与Bi-control 组相比，Bi-miR378 组中Runx1t1、Galnt3和RAB10的富集程度有显著的升高，其中Runx1t1富集程度上升了约6 倍，Galnt3和RAB10分别上升了约3.5 和3 倍，而阴性对照GDF6的富集在两组中没有发生变化（图4）。Pulldown 实 验 结 果 说 明miR-378 与Runx1t1、Galnt3和RAB10基因的mRNA 的确存在相互结合。

图1 miR-378 增加3T3-L1 脂肪细胞脂质生成

图2 miR-378 调控脂质相关基因的表达

图3 miR-378 与候选靶基因结合位点在不同物种间的序列对比

图4 Biotin-miRNA 捕获靶基因的富集分析

2.3 报告基因实验验证miR-378的靶位点

为了进一步验证miR-378 pulldown 的结果以及确定miR-378 的靶位点，本实验通过PCR 扩增获得了包含Runx1t1、Galnt3、RAB10靶位点的目的片段，其中GDF63'UTR 区的任意序列作为阴性对照（图5），克隆构建了4 个报告基因载体，再通过测序确认插入序列的正确性（图6）。将4 个载体分别与miR-378 类似物共转染到HEK293 细胞中，培养48 h后，分别检测4 个报告基因相对荧光值的变化。通过与Control 组相比，发现在miR-378 组中Runx1t1、Galnt3和RAB10的相对荧光值有显著的下降，其中Runx1t1相对荧光值下降了约50%，Galnt3和RAB10分别下降了约40%和30%，而GDF6的相对荧光值在两组中没有发生变化（图7），说明miR-378 是通过图3 中预测的靶位点与3 个靶基因互作的。

图5 候选基因PCR 目的片段的电泳图

图6 四个报告基因插入片段的测序峰图

图7 报告基因载体双荧光素酶活性检测

3 讨论

miR-378 在动物及人的各脏器组织中都有表达，其中已有大量研究表明miR-378 在脂肪组织中存在着较高的丰度［15-17］。在脂肪组织中TNF-a、IL-6和leptin等重要的脂肪分化因子调控miR-378 的生成［18］。在间充质前体细胞中过表达miR-378 后发现了细胞中脂滴体积的增加［19］。小鼠全身性敲除miR-378 后出现了体重明显降低，皮下脂肪体积显著减少的现象，进一步研究发现miR-378 影响了甘油三酯的沉积［9］；miRNA-378 还可以控制棕色脂肪组织产热，从而起到缓解肥胖的效果［20-21］。本研究通过在前体脂肪细胞3T3-L1 细胞中过表达miR-378 后，也发现了脂滴增加的现象，进一步说明了miR-378有促进脂质生成的作用。同时本研究还发现miR-378 能调控脂肪合成相关基因PGC-1α和PPAR-γ表达上调，其中，PPAR-γ在脂肪细胞发育过程中具有重要的调控作用，参与脂肪细胞的增殖、分化和代谢过程［22-23］，而PGC-1α是PPAR-γ的激活剂［24］；此外，还发现miR-378 可下调脂肪分解基因ATGL和CGI-58表达，其中ATGL是甘油三酯脂酶，能引发甘油三酯水解成脂肪酸［25-26］，而CGI-5是ATGL的激活剂［27-28］。这说明在脂肪细胞中miR-378 不仅可以直接促进脂质合成，还可以间接降低脂质分解，通过这两条途径影响脂肪总量。但在这些脂肪相关基因的3'UTR 区并没有预测到miR-378 靶位点，而有研究发现miR-378 可促进重要调控因子（比如C/EBPα、C/EBPβ等）的转录从而控制脂肪相关基因的表达［19，29］，所以miR-378 可能通过相关因子间接调控这些基因的表达水平。

miR-378 虽然可以促进脂肪细胞脂质生成，但目前直接报道与之相关的靶基因较少，miR-378 可靶向调控MAPK1基因，促进前体脂肪细胞分化［18，30］。为了获得更多与脂肪细胞相关的靶标关系，本研究把miR-378 和靶基因结合位点的保守性作为筛选的标准，成功证实了所有候选的靶基因，说明如果miRNAs 与靶基因的结合位点在物种间高度保守的话，那么这个位点更有可能成为靶位点。本研究验证得到miR-378 的一个与脂肪合成直接相关的靶基因Runx1t1，它是脂肪细胞分化和脂质合成的抑制因子，过表达Runx1t1会抑制脂质的生成，前体脂肪细胞分化过程中Runx1t1的表达下调［31-33］。同时还获得了miR-378 两个与脂肪细胞能量代谢相关的靶基因，其中Rab10特异性地参与了脂肪细胞中胰岛素调控的葡萄糖转运过程［34-36］，而Galnt3通过与FGF23结合调控脂肪细胞肥大和胰岛素敏感［37-38］。这些靶标关系的获得为进一步探索miR-378 在脂肪细胞中的功能提供了理论依据。

报告基因克隆的传统miRNAs 靶标验证手段不但低效而且假阳性率较高，而近年来随着miRNAs作用机制的多元化以及高通量测序技术的迅猛发展，目前很多研究已证实microRNA pulldown 技术在miRNAs 靶标验证上的高效、快捷、批量等特点［39-41］，但由于miRNAs 与mRNA 的结合方式是以种子序列与靶位点的碱基互补配对为主，这也必然导致microRNA pulldown 的结果也会呈现出较高概率的假阳性。而本研究利用microRNA pulldown 技术高效快速地证明了miR-378 与Runx1t1、Rab10和Galnt3mRNA 的相互作用，再运用报告基因实验进一步确定了靶标关系以及相互结合靶位点，这说明两个技术相结合可以大大降低了假阳性的出现。本研究不仅确认了miR-378 在脂肪细胞中的靶向目标，同时也为microRNA pulldown 技术的结果提供了一定的数据支撑。但随着miRNAs 多样化调控方式研究的深入［13］，microRNA pulldown 技术也必将更适合miRNAs 复杂的作用机制。

4 结论

本研究发现了在脂肪细胞中miR-378 能促进脂质生成且影响脂肪合成和分解相关基因的表达水平，还获得了3 个与脂肪功能相关的重要靶基因，为microRNA pulldown 技术在miRNAs 靶标关系验证中的准确度和高效性提供了一定的数据支撑。