基于Th1/Th2失衡及炎症反应探讨封髓丹加味对痤疮的影响*

徐俊涛，方玉甫，2△，王 莹，王 丽，赵 巍

(1. 河南省中医院，郑州 450003； 2. 河南中医药大学,郑州 450000)

痤疮是常见的慢性皮肤疾病之一，多发于青春期，好发于面部、胸口、背部等皮脂腺丰富处，常伴有瘙痒、疼痛、瘢痕等，且病情容易反复，严重影响患者身心健康[1]。痤疮的发病机制尚未明了，普遍认为与痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes，P.ances)诱发的免疫反应有关[2]。目前，临床用于痤疮的局部用药有维A酸类、过氧化苯甲酰、抗生素等，以维A酸类治疗效果最好，但有致畸、致抑郁、肝损害的风险[3]。因此，开发疗效好、不良反应小的痤疮药物具有重大临床意义。研究发现，免疫功能紊乱可能参与痤疮炎症的发生发展。P.ances可刺激T淋巴细胞异常增殖，过度分泌致炎因子和淋巴因子，机体免疫模式由Th1辅助细胞偏向Th2细胞[4]。最近研究表明，Toll样受体家族(the toll-like receptor family，TRLs)在痤疮炎症中发挥重要的调控作用。P.ances可激活TRLs，诱导一系列级联反应，活化核转录因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)，最终导致局部炎症[5]。临床研究发现，封髓丹加味治疗上浮型玫瑰痤疮疗效较好[6]，但封髓丹加味与痤疮的相关机制研究较少。本研究利用P.ances构建痤疮大鼠模型，首次基于Th1/Th2失衡及炎症反应探讨封髓丹加味对痤疮大鼠的影响，并初步分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备

P.ances(菌种编号：ATCC6919)中国药品生物制品鉴定所；多聚甲醛(R20493)、苏木素(S19007)、伊红(R24045)上海源叶生物科技有限公司；白细胞介素2(interleukin-2，IL-2，SBJ-R0757)、干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ，SBJ-R0041)、白细胞介素4(interleukin-4，IL-4，SBJ-R0756)、白介素介素10(interleukin-10，IL-10)(SBJ-R0786)、

ELISA试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司；蛋白一抗TRL2(ab209217，TRL4 ab8378)、核转录因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)(ab32536)、p- NF-κB(ab86299)、β-actin(ab8226)，美国Abcam公司。

BX43光学显微镜(美国Olympus公司)；GelSMART凝胶成像仪(北京大龙兴创实验仪器有限公司)。

1.2 动物

SD雄性大鼠，6～8周龄，体质量200～240 g，由广州弗尔博生物科技有限公司提供，动物许可证号SCXN(粤)2019-0015。大鼠自由摄食进水，饲养于SPF级动物房中，适应性喂养3 d后用于实验。本实验已通过河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)实验动物伦理委员会审查(批号1117-01)。

2 方法

2.1 造模

制备P.ances混悬液，调整细菌浓度值3×108/mL；于大鼠双侧耳廓皮下注射P.ances混悬液50 μL。注射24 h后观察到耳廓组织出现红肿，并有红色丘疹形成；挑取耳廓肿胀部位组织做血平板培养，显微镜下观察证实为P.ances感染。

2.2 分组与给药

40只SD大鼠随机分为对照组、模型组和封髓丹加味低、中、高剂量治疗组5组各8只。模型组和药物治疗组均注射P.ances混悬液构建痤疮大鼠模型，对照组以生理盐水替代。封髓丹加味组成：(总量167 g)、砂仁20 g，黄柏、龟甲、龙骨、牡蛎、白茅根15 g，甘草、浮萍、茯苓皮、凌霄花、鸡冠花12 g，附子、红花6 g。将上述药方换算为大鼠等效剂量15.90 g/(kg·d)，因此确定封髓丹加味低、中、高剂量分别为7.95、15.90、31.80 g/(kg·d)；按配比称取各味药物，加蒸馏水熬制并浓缩为7 g/mL，再稀释为含生药1.75 g/mL、3.5 g/mL及7 g/mL的中药液作为低、中、高剂量。封髓丹加味低、中、高剂量治疗组于建模后24 h灌胃给药，对照组和模型组以蒸馏水替代，每天1次，连续灌胃7 d。

2.3 大体观察

干预完成后观察记录各组大鼠耳部皮损情况(红肿、丘疹等)并进行皮损评分。评分标准：耳廓注射部位无红斑、丘疹及脓疱等，记为0分；耳廓注射部位以红斑为主，记为1分；耳廓注射部位变现为红斑、炎性丘疹，记为2分；耳廓注射部位变现为红斑、炎性丘疹和脓疱，记为3分；耳廓注射部位红斑面积大，大量炎性丘疹、脓疱且伴有较大脓肿，记为4分[7]。采用双盲法进行评分，取均值为最终结果。

2.4 组织病理观察

干预完成后腹腔过量注射10%水合氯醛，窒息处死大鼠，迅速割取耳部注射处皮肤组织部分固定于多聚甲醛中，剩余冻存于液氮罐。耳廓组织固定后制备成石蜡切片，厚度约4 μm，行常规HE染色，光镜下观察耳部皮损处病理变化并计数炎症细胞数量。

2.5 细胞因子水平检测

于液氮罐中取出适量耳廓皮损组织，加入少量液氮快速研磨成粉末，冰上匀浆；参照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，检测IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10含量。

2.6 TRL/NF-κB通路相关蛋白表达检测

于液氮罐中取出适量耳廓皮损组织，加入少量液氮快速研磨成粉末；加入裂解液提取皮损组织中的总蛋白，经BCA试剂盒检测蛋白浓度，10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，再湿转至PVDF膜；浸于5%脱脂牛奶中封闭1 h，置于不同稀释比的蛋白一抗(TRL 2∶1∶1000， TRL 4∶1∶1500，NF-κB：1∶1000，p- NF-κB：1∶1000，β-actin：1∶1000)中4 ℃反应过夜，再置于稀释比为1∶8000的二抗中室温下反应40 min；应用凝胶成像仪显示蛋白条带，Image J软件进行灰度处理。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠耳部大体观察及皮损评分比较

表1示，对照组大鼠双侧耳廓无变化，模型组大鼠耳廓明显增厚、红肿，耳部较硬且表面粗糙，有红色丘疹；不同剂量封髓丹加味治疗后大鼠耳廓增厚和红肿症状有明显改善，丘疹明显消退，以高剂量组疗效最显著(如图1)。各组大鼠耳廓皮损评分比较差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，封髓丹加味治疗组皮损评分显著降低(P<0.05)，具有浓度依赖性。

注：A.对照组；B.模型组；C.封髓丹加味低剂量治疗组；D.封髓丹加味中剂量治疗组；E.封髓丹加味高剂量治疗组图1 各组大鼠耳部皮肤观察比较

表1 各组大鼠耳部皮损评分比较(分，

3.2 各组大鼠耳部组织病理变化及炎性细胞计数比较

图2示，对照组大鼠耳部真皮内少有细胞浸润，细胞结构完整；模型组真皮内大量炎症细胞浸润，间质内伴有出血和水肿；封髓丹加味低、中、高剂量治疗组炎性浸润、间质出血和水肿程度明显减轻，且高剂量组减轻最明显。各组大鼠皮损组织中炎性细胞计数比较差异有统计学意义(P<0.05)。表2示，与模型组比较，封髓丹加味治疗组炎性细胞计数显著下降(P<0.05)。

注：A.对照组；B.模型组;C.封髓丹加味低剂量治疗组；D.封髓丹加味中剂量治疗组；E.封髓丹加味高剂量治疗组图2 各组大鼠耳部组织病理变化比较(HE×200)

表2 各组大鼠皮损组织中炎性细胞计数比较

3.3 各组大鼠耳部皮损组织细胞因子水平比较

表3示，各组大鼠皮损组织中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10水平比较差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，封髓丹加味治疗组IL-2、IFN-γ水平显著上升，IL-4及IL-10水平显著下降(P<0.05)，且具有浓度依赖性。

表3 各组大鼠皮损组织中细胞因子水平比较

3.4 各组大鼠耳部皮损组织TRL/NF-κB通路相关蛋白表达比较

图3表4示，各组大鼠皮损组织中TRL2、TRL4及p-NF-ΚB/NF-ΚB的表达比较差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，封髓丹加味治疗组大鼠皮损组织中TRL2、TRL4及p-NF-ΚB/NF-ΚB的表达显著下调(P<0.05)，呈剂量依赖性。

注：a.对照组；b.模型组；c.封髓丹加味低剂量治疗组；d.封髓丹加味中剂量治疗组；e.封髓丹加味高剂量治疗组图3 各组大鼠皮损组织中TRL2、TRL4、p-NF-ΚB及NF-ΚB的蛋白印迹表达

表4 各组大鼠皮损组织中TRL2、TRL4及p-NF-ΚB/NF-ΚB表达比较

4 讨论

痤疮属于中医学“肺风粉刺”“粉刺”等范畴。虚阳上浮型痤疮病机为肺经血热、外遇风寒，引起血瘀凝滞，主要涉及肺、胃、脾、肾等脏，症状表现为面部红斑、灼热，手足冰冷、畏寒，舌红少苔等[8]。封髓丹出自郑钦安的《医理真传》，由黄柏、砂仁、甘草等组成，用于肾虚不固、风火相扇者，能够达到温肾降火、活血消肿的功效[9]。研究报道，封髓丹加味具有温肾潜阳、活血消肿之效，可有效改善红斑、灼热及水肿，可用于虚阳上浮型玫瑰痤疮的治疗[6]。本研究发现，封髓丹加味可有效改善痤疮大鼠耳廓增厚、红肿及丘疹症状，减轻耳廓皮损组织中炎性浸润、间质出血和水肿程度，可能与封髓丹加味中砂仁、黄柏、龟板、附片及甘草纳气归肾，茯苓皮、白茅根具有利水消肿之效有关[10]。现代药理研究也表明，封髓丹加味可能通过抑制神经血管免疫反应，减少痤疮患者症状[11-12]。

痤疮的发病机制具有多因素性和复杂性，主要因素有过度角化、炎症反应、皮脂腺调控异常等。近年来发现，免疫功能紊乱可能参与痤疮炎症的发生发展。痤疮形成过程中，角质形成细胞和皮脂腺细胞可表达多种细胞因子，如IL- 2、TNF- α及IFN-γ等，引起炎性细胞的趋化聚集[13]。Th1和 Th2细胞均为辅助性T细胞(helper T cell，Th)，Th1细胞可分泌IL- 2、IFN-γ及肿瘤坏死因子-β等细胞因子，介导细胞免疫；Th2细胞可分泌 IL- 4、IL- 10及IL- 13等细胞因子，介导体液免疫[14]。IL- 4和IFN-γ是Th分化过程中的重要调控因子，Th1和Th2细胞可通过细胞因子相互调节、抑制，达到动态平衡。Mélanie Saint-Jean 等[15]研究指出，Th1/Th2 失衡在痤疮的发生发展中有关键作用，痤疮患者存在Th1/Th2失衡，且与患者病情严重程度密切相关。本研究发现，痤疮大鼠皮损组织中IL-2、IFN-γ水平明显下降，IL-4及IL-10水平明显上升，表明痤疮大鼠体内免疫模式由Th1细胞偏向Th2细胞。与崔力[16]等研究相符，提示封髓丹加味可纠正Th1/Th2失衡，从而减轻痤疮症状。

Th1/Th2分泌的细胞因子位于TRL/NF-κB信号通路下游，TRL/NF-κB信号通路可通过下游炎症因子调控免疫应答[17]。另外研究发现，角质形成细胞和皮脂腺细胞均可表达TRL2和TRL4，P.ances可激活TRLs的表达，从而活化NF-κB的表达，级联式放大炎症信号，破坏Th1和Th2 细胞因子的平衡，最终引起痤疮炎症[18]。本研究发现，封髓丹加味治疗后，痤疮大鼠皮损组织中TRL2、TRL4及NF-κB磷酸化水平显著降低，表明封髓丹加味可阻断TRL/NF-κB信号通路，调控Th细胞因子的释放，促使Th1和Th2细胞因子恢复平衡，从而改善痤疮大鼠的炎性皮损状态。

本研究初步探究了封髓丹加味对TRL/NF-κB信号通路及Th1/Th2平衡的影响，为阐明本方治疗痤疮的作用机制奠定了基础。但封髓丹加味方中成分较多，具体是哪种成分干预痤疮免疫尚不清楚；同时封髓丹加味治疗痤疮是否还具有其他作用机制，尚需进一步探究。