抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠心肌纤维化相关蛋白表达的影响*

王振涛，边汝涛，杨凤鸣，刘嫄淑，吴 鸿

(1. 河南省中医院，郑州 450003； 2. 河南中医药大学，郑州 450046)

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一类以单侧或双侧心室扩大并伴有收缩功能障碍为主要特征的心肌疾病，我国发病率约13～84/10万，5年病死率约为42.24%[1]。DCM的主要病理变化为心室重构，而心肌纤维化是心室重构的重要病理变化，故抑制心肌纤维化是治疗DCM的一个重要方向[2]。心肌成纤维细胞的增殖、转分化在心肌纤维化中具有重要地位[3]，在转分化的心肌成纤维细胞内可进一步激活α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、I型胶原蛋白(Collagen I，CoI-1)等心肌纤维化相关因子，从而导致心肌纤维化的发生发展[4]，而心房利钠肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)、B型利钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)是心功能变化的重要指标。

抗纤益心方是临床治疗扩张型心肌病的有效方剂[5]。前期基础研究发现，抗纤益心方具有改善DCM模型大鼠心室重构的作用[6-7]，但其对心肌纤维化的作用机制研究仍未明确。本研究通过DCM大鼠模型探讨抗纤益心方抑制心肌纤维化的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wister雄性大鼠100只，出生后4周，体质量(52.31±5.65)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SYXK(豫)-2016-0006)。所有大鼠均饲养于河南中医药大学第二附属医院中心实验室SPF级动物实验中心，室温在(22±3)℃，湿度控制在(45±5)%，12 h光暗循环。本研究由河南中医药大学第二附属医院伦理委员会批准，本单位伦理学批件无批号。

1.2 药物

抗纤益心方药物组成：红参12 g，黄芪30 g，茯苓15 g，白术15 g，丹参15 g，升麻9 g，麦冬12 g，泽兰15 g，益母草15 g。以上配方颗粒购自四川新绿色科技发展有限公司，药物质量采用 GMP 认证(证书编号SC20150037)。将1剂中药配方颗粒溶于煮沸的20 mL生理盐水中充分搅拌均匀，再用微波炉煮沸2次，使药物完全溶解即为中药原液，其浓度为0.57 g/ml,保存于4 ℃备用。卡托普利片购自上海上药信谊药厂有限公司(批号63170904)， 25 mg/片；呋喃唑酮片购自天津力生制药股份有限公司(批号12020160)，100 mg/片。

1.3 主要试剂

Masson三色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号G1340)；α-SMA、CoI-1抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，货号14395-AP、14695-1-AP)；CTGF抗体(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号E-AB-12339)；GAPDH(武汉博士德生物技术有限公司，货号BM3876)；辣根过氧化物标记羊抗免疫球蛋白、辣根过氧化物标记羊抗鼠免疫球蛋白(武汉塞维尔生物科技有限公司，货号GB23204、GB23301)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(西安晶彩生物科技有限公司，货号JC-PE001)；PVDF膜(美国Millipore公司，货号IPHV0010)；RNA提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司，货号B518651)；cDNA逆转录试剂盒(Takara Bio，货号6210 A)；荧光定量试剂盒(Takara Bio，货号RR430 A)。

1.4 主要仪器

小动物超声仪(德国西门子股份公司，型号：Acuson Cypress)，石蜡切片机(湖北慧达仪器公司，型号：HD-325)；组织包埋机(湖北慧达仪器公司，型号：HD-310)；凝胶电泳仪(美国伯乐，型号：164-5070)、光学显微镜(日本OLYMPUS公司，型号：CKX41)；摄影显微镜(德国莱卡公司，型号：ICES-003)；CFX96实时荧光定量PCR仪(美国伯乐，型号：185-2148)。

2 方法

2.1 DCM大鼠模型建立

100只大鼠适应性喂养1周后随机分为造模组90只和正常组10只，按照文献[8]和前期研究方法复制DCM大鼠模型，在造模组大鼠饮用水中加呋喃唑酮(按1 kg去离子水加700 mg呋喃唑酮)喂养。造模组大鼠连续10周自由饮用呋喃唑酮水溶液，正常组大鼠同期自由饮用去离子水，造模期间造模组及正常组均无死亡。10周后对造模大鼠进行心脏超声心动图检查，造模成功大鼠室壁运动符合DCM影像学改变，且射血分数与正常组有明显统计学差异。

2.2 分组及给药

将造模成功大鼠随机分为模型组、抗纤益心方高剂量组、抗纤益心方中剂量组、抗纤益心方低剂量组和卡托普利组5组各10只。根据《药理实验方法学》提供的计算方法，抗纤益心方高剂量组灌胃量为18.8 g/(kg·d)、中剂量组9.4 g/(kg·d)、低剂量组4.7 g/(kg·d)，卡托普利组灌胃10.125 mg/(kg·d)，正常组、模型组灌服等量的生理盐水[9]。同时模型组、抗纤益心方各治疗组及卡托普利组大鼠继续自由饮用呋喃唑酮水溶液，以保证致病因素的持续存在。

2.3 取材

药物干预4周后，用4%水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉，检测各组大鼠心脏超声射血分数(ejection fraction，EF)、左室短轴缩短率(fractional shortening，FS)等相关指标后处死动物，开胸迅速取出心脏。部分大鼠心肌组织用PBS洗涤残留血液后，用组织剪剪切成 1 cm3左右的小块，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中备用。另取部分大鼠心肌组织在预冷的生理盐水中冲洗残留的血液成分，然后用4%多聚甲醛溶液固定，24 h后进行组织脱水、包埋、切片。

2.4 Masson染色观察大鼠心肌纤维化情况

组织切片后脱蜡至水，依次用苏木素染色、分化、返蓝、丽春红品染色、苯胺蓝染色、脱水、二甲苯透明，中性树脂胶封片。在显微镜下观察各组切片染色情况，肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，随机选取5个视野留取图像进行分析。

2.5 Real-time PCR法检测大鼠心肌组织ANP、BNP、CTGF、α-SMA mRNA的表达

表1示，取各组大鼠心肌组织50 mg加入到Buffer Rlysis-AG溶液中，匀浆后静置5 min，12000 r/min离心5 min，离心2次，取上清加入1/2体积的无水乙醇，混匀后加入到组织柱式RNA提取柱中，按照操作步骤依次加入GT Solution、NT Solution等溶液，提取总RNA溶液，测定总RNA浓度及纯度后逆转录为cDNA。以cDNA为模板行Real-time PCR检测，以正常组为参照组，β-actin为内参，用2-ΔΔCt表示mRNA的相对表达，计算各组的表达量。ANP、BNP、α-SMA、CTGF、β-actin引物由上海生工合成。

表1 ANP、BNP、α-SMA、CTGF、β-actin引物合成序列

2.6 Weston blot法检测大鼠心肌组织CTGF、α-SMA、CoI-1的表达 取各组大鼠心肌组织30 mg加入200 μL RIPA裂解液中，冰上裂解1 h，4 ℃ 12000 r/min离心10 min，取上清即为总蛋白液。BCA法检测蛋白浓度，100 ℃金属浴10 min，冰上静置10 min，4 ℃ 12000 r/min离心5 min，上清即为上样液。在SDS-PAGE胶中电泳，电泳结束后转印至PVDF膜上，转印结束后取出膜在5%脱脂牛奶中封闭1 h。用5%脱脂牛奶配制孵育抗体：CTGF(1∶1000)、α-SMA(1∶1500)、CoI-1(1∶2000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5次，每次5 min，洗膜结束后用二抗孵育1.5 h，TBST洗膜5次，每次5 min。将条带放入ELC显影液，用凝胶图像处理系统分析条带灰度值，用目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示蛋白相对表达量。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 正常组与模型组大鼠心脏超声检测结果

表2示，造模10周后超声心动图检测造模大鼠与正常组心功能，结果发现造模成功大鼠心室壁运动幅度降低，舒张末内径(Left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)及收缩末内径(Left ventricular end systolic diameter，LVESD)较正常组扩大(P<0.05或P<0.01)，EF降低(P<0.01)，造模成功大鼠共计50只。

表2 模型组与正常组大鼠心脏超声情况

3.2 抗纤益心方对DCM模型大鼠心功能影响

表3示，与正常组比较，模型组大鼠EF、FS下降(P<0.01)；与模型组比较，抗纤益心方各组及卡托普利组大鼠给予药物干预4周，EF、FS较模型组均有明显升高(P<0.05或P<0.01)，且升高程度与抗纤益心方浓度增加具有明显的量效关系。

表3 抗纤益心方对DCM模型大鼠心脏超声指标EF、FS的影响

3.3 抗纤益心方对DCM模型大鼠心肌组织纤维化的影响

图1示，在400倍光镜下，正常组大鼠心肌组织仅见少量的心肌胶原纤维。与正常组比较，模型组心肌组织可见大量蓝色心肌胶原纤维增生，心肌纤维化程度显著加重。与模型组比较，抗纤益心方高、中剂量组及卡托普利组可见蓝色心肌胶原纤维明显减少，而低剂量组仍可见大量心肌胶原纤维增生。

注：1.正常组；2.模型组；3.高剂量组；4.中剂量组；5.低剂量组；6.卡托普利组图1 各组大鼠心肌组织心肌胶原纤维化Masson染色(400×)

3.4 各组大鼠心肌组织ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表达水平

表4示，与正常组比较，模型组ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，抗纤益心方高、中剂量组及卡托普利组都有不同程度的降低(P<0.01)，而抗纤益心方低剂量组α-SMA、CTGF mRNA表达水平降低不明显(P>0.05)。

表4 各组大鼠心肌组织ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表达水平比较

3.5 各组大鼠心肌组织CTGF、α-SMA、CoI-1蛋白表达水平

图2表5示，与正常组比较，模型组α-SMA、CTGF、CoI-1表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，抗纤益心方高、中剂量组及卡托普利组表达水平都有明显降低(P<0.05或P<0.01)，而低剂量组降低不明显(P>0.05)。

表5 抗纤益心方对CTGF、α-SMA、CoI-1蛋白表达水平影响比较

图2 抗纤益心方对CTGF、α-SMA、CoI-1蛋白表达水平的影响

4 讨论

临床实践表明，中医药在扩张型心肌病治疗中具有良好的疗效。中医认为本病基本病机为本虚标实，心气亏虚为基础，心阳不振为后期之根本，血瘀、水湿为病理产物，是疾病发展及加重的重要因素，其病位在心，常累及肺、脾、肝、肾等脏腑，故临床治疗多采用益气、活血、利水等措施[10]。王振涛根据本病的病因病机自拟具有益气活血作用的中药复方抗纤益心方。抗纤益心方在升陷汤及补中益气汤的基础上化裁而来，重用黄芪为君药以补气，红参既可补脾胃之气又可补元气、肺气，白术有燥湿健脾之功效，从而使气血生化有源；针对本病瘀血水湿停留等实邪，加入丹参、茯苓、益母草、泽兰等以化瘀利水，诸药合用使气血生化有源，瘀血、水湿得化，从而有效治疗扩张型心肌病。

心肌纤维化在病理形态上主要表现为胶原沉积，各型胶原比例失调，尤其是Ⅰ型、Ⅲ型胶原的比例升高、排列紊乱，同时伴有心肌成纤维细胞的增生[11]。心肌成纤维细胞是调节细胞外基质合成与降解的主要细胞[12]。血管紧张素Ⅱ、醛固酮、内皮素等刺激因子可促进心肌成纤维细胞的增殖及转分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞合成分泌胶原蛋白的能力远大于成纤维细胞，是胶原蛋白合成的主要来源细胞[13]。α-SMA是国际认可的肌成纤维细胞活化的标志性蛋白，肌成纤维细胞可大量合成I、III型胶原蛋白，从而导致胶原代谢异常[14]。CTGF是一种促成纤维细胞分裂和胶原沉积的细胞因子，可介导血管紧张素Ⅱ、TGF-β的部分生物效应[15]，从而刺激心肌成纤维细胞增殖和细胞外胶原的沉积，在促进组织纤维化方面起到重要作用。

本次研究结果显示，抗纤益心方具有改善DCM模型大鼠心功能的作用，与前期实验结果一致[6]。抗纤益心方高、中剂量组及卡托普利组可明显改善大鼠心脏超声EF、FS值，而低剂量组改善不明显。抗纤益心方各组及卡托普利组可明显降低DCM模型大鼠心肌组织中ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表达水平，且抗纤益心方高、中剂量组及卡托普利组可显著降低DCM模型大鼠心肌组织中α-SMA、CTGF、CoI-1蛋白表达水平，而低剂量改善不明显。综上所述，抗纤益心方可能通过抑制心肌成纤维细胞的增殖、转分化，从而抑制DCM模型大鼠心肌纤维化的发展，但其作用途径仍需今后进一步的深入研究。