小檗碱通过抑制Th1恢复IFN-γ/IL-4平衡减轻迟发型超敏反应*

陶文婷，陈姣姣，高清华，翟 毅，李蔚华△

(1. 湖北中医药大学基础医学院，武汉 430065； 2. 华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉 430077)

迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity, DTH)是公共健康面临的重要挑战之一。据统计，全世界约有15%～20%的人患有此种疾病[1]。DTH发生较慢，通常在接触相同抗原24～72 h后出现炎症反应[2]，是一种由特异性T细胞介导的细胞免疫应答，其主要效应细胞是CD4+Th1细胞[3]，临床特征主要为单核细胞浸润和组织损伤。

小檗碱是从传统中药黄连和黄柏中提取出来的异喹啉类生物碱[4]，具有多种药理作用，如抗炎、抗肿瘤、降血糖、调血脂、保护新血管以及免疫抑制等[5-7]。在动脉粥样硬化中，小檗碱能够抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路，阻碍NF-kappa-B inhibitor alpha(IkB-α)磷酸化和p65蛋白核转位，发挥抗炎作用[8]；在溃疡性结肠炎中，小檗碱活化信号传导因子和转录激活因子(signal transducing activator of transcription，STAT)1和STAT3降低Th17和Th1细胞分化，抑制白介素-17(interleukin-17，IL-17)及γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)分泌发挥抗炎作用[9-10]。有研究表明，在类风湿性关节炎中，小檗碱可通过下调p-ERK、p-P38和p-JNK表达发挥抗炎作用，减少炎症细胞浸润，改善关节组织破坏情况[11]。同时小檗碱具有免疫毒性，在DTH中发挥免疫抑制作用，但其具体机制不明[12]。本研究使用小檗碱作用于迟发型超敏反应小鼠，观察其抗炎效应并探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级32只雌性C57BL/6小鼠，体质量18～20 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号SCXK(辽)2015-0001。在室温(20 ± 2)℃，12 h光照，自由饮食环境适应性喂养1周。本实验已通过湖北中医药大学实验动物伦理委员会审查(伦理学批号HUCMS2018101102)。

1.2 药品与试剂

小檗碱(货号B3251)、12.5%EDTA(货号D2900000)、卵清蛋白(ovalbumin, OVA，货号O1641)、弗氏完全佐剂(货号F5881)、刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A，货号L7647)等购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养基(货号21870100)、胎牛血清(货号10099133C)、抗生素(5000 μ/mL链霉素和青霉素，货号15070063，购自美国Gibco公司；小鼠淋巴细胞分离液(货号7200100)，购自中国达科为公司；γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ，货号25712)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α，货号24835)和白介素-4(interleukin-4，IL-4)(货号287287)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒，购自中国欣博盛公司。

1.3 主要仪器

冰冻切片机(CM1860UV，德国Leica公司)；倒置显微镜(BX40F4，日本尼康公司)；离心机(FC5515R，美国OHAUS)；CO2培养箱(MCO-18 A型，日本松下公司)；酶标分析仪(DNM-9602，北京普朗新技术有限公司)。

2 方法

2.1 造模与分组

动物按照随机数字表法分为对照组、DTH组、小檗碱组、DTH+小檗碱组4组各8只，随机编号称重。DTH组在第1天皮下注射致敏剂(将50μg OVA 溶于50 μL生理盐水中，然后用50 μL完全弗氏佐剂乳化)，第8天于左足垫注射激发剂(将200μg 热聚OVA溶解于20 μL的PBS中)，右足垫注射等体积的PBS作为对照，24 h后颈椎脱臼处死取材。小檗碱组第2天至第8天腹腔注射小檗碱(10 mg/(kg·d)溶于0.05%DMSO(图1)，对照组仅腹腔注射等量0.05%DMSO。

图1 造模示意图

2.2 观察指标与方法

2.2.1 小鼠足垫厚度测量 游标卡尺测量小鼠双后肢足垫厚度，足垫肿胀程度=OVA注射侧足垫厚度-PBS注射侧足垫厚度。

2.2.2 HE染色 分离足垫组织，常规制片，用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)进行染色，镜下观察并进行炎性细胞计数。随机选取5个视野(×400)，对视野中的淋巴细胞及单核细胞进行计数，最后取平均值。

2.2.3 ELISA检测 将足垫进行组织匀浆，离心后取上清，用ELISA试剂盒检测IFN-γ、 TNF-α和IL-4水平，按照试剂盒说明书进行检测。

2.2.4 脾脏单个核细胞制备 取脾脏组织置于培养皿中，加入淋巴细胞分离液分离脾脏组织，将样本转移至15 ml离心管中，并覆盖500 μL RPMI 1640培养基，室温下800 g离心30 min，吸取第2层环状乳白色液体(淋巴细胞层)于另1个干净离心管中，加入5 ml红细胞裂解液，4 ℃静置5 min后加入PBS 5 ml，350 g离心5 min，洗涤1～2次，最后沉积于试管底部的即为淋巴细胞。加入RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清及100 U/mL链霉素和青霉素)重悬细胞并接种于培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱孵育过夜，次日取未贴壁细胞为脾脏单个核细胞，台盼蓝染色并进行细胞计数，调整浓度1×106个/mL。

2.2.5 ConA刺激实验 将2 mg Con A溶于100 μL RPMI 1640培养基中，然后用培养基稀释至5μg/mL。取不同组的脾脏单个核细胞悬液100 μL到96孔细胞培养板中，再分别加入100 μL ConA稀释液，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育72 h，收集上清，ELISA法检测IFN-γ水平。

2.2.6 OVA致敏检测 从DTH组小鼠获得的脾脏单个核细胞悬液接种至 96孔培养板中，2×106/孔，设置空白对照组、OVA组和0.1、1、10 μM浓度的小檗碱组。将培养基置于37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育72 h，收集上清，用ELISA检测IFN-γ、IL-4水平。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 小檗碱抑制OVA诱导DTH

表1、2示，DTH模型小鼠足垫肿胀明显，低[0.1 mg/(kg·d)]、中[1 mg/(kg·d)]剂量小檗碱处理无明显影响。当小檗碱浓度为10 mg/(kg·d)时，足垫肿胀程度明显减轻(P<0.001)，故后续实验使用小檗碱浓度为10 mg/(kg·d)。用OVA诱导DTH，DTH组的足垫明显肿胀(P<0.001)与之比较，DTH+小檗碱组肿胀程度明显减轻(P<0.001)。

表1 不同剂量小檗碱对DTH小鼠足垫肿胀的影响

表2 各组足垫组织增长的厚度比较

3.2 小檗碱减少DTH小鼠足垫组织炎性细胞浸润

表3示，HE染色与DTH组比较，DTH+小檗碱组炎性细胞浸润数目显著减少(P<0.001)，提示小檗碱可抑制足垫组织炎症细胞浸润，改善小鼠足垫炎症情况。

表3 各足垫组织炎性细胞数目比较(个

3.3 小檗碱减轻DTH炎症因子释放

表4示，ELISA检测显示，与DTH组比较DTH+小檗碱组足垫组织中的IFN-γ、TNF-α水平明显减少(P<0.001)，而两者IL-4水平比较差异无统计学意义。

表4 足垫组织炎性因子水平比较

3.4 小檗碱抑制Th1反应

表4示，分离小鼠脾脏单个核细胞并体外培养，给予ConA刺激，DTH组IFN-γ分泌明显增加。与DTH比较，DTH+小檗碱组分泌的IFN-γ明显减少(P<0.01)，结果提示小檗碱处理能够抑制Th1反应，其效应与抗炎作用相关。

表5 ConA检测各组脾脏单个核细胞中IFN-γ水平比较

3.5 小檗碱恢复IFN-γ/IL-4平衡

表6示，OVA致敏实验显示，小檗碱处理抑制IFN-γ分泌，其效应与浓度正相关，但对IL-4无明显影响，最终使IFN-γ/IL-4比例明显下降并恢复平衡。

表6 小檗碱对脾脏单个核细胞IFN-γ和IL-4的影响比较

4 讨论

本实验使用OVA诱导的DTH模型，其致敏过程在相对较短时间内就能完成，广泛应用于药物免疫调节和抗炎作用的研究[13]。该模型的建立分为2个阶段：在致敏阶段，OVA诱导区域淋巴结中T淋巴细胞的活化和增殖；在效应阶段，OVA再刺激引发T淋巴细胞和巨噬细胞募集至攻击部位，产生多种炎症介质并增强DTH的炎症反应[14]。本研究发现，与对照组比较DTH组足垫厚度明显增加，炎性细胞数目增多，且炎症因子表达显著增加；脾脏单个核细胞中IFN-γ分泌增多，DTH组发生Th1极化，产生炎症反应。

根据细胞因子环境的不同，可以使Th0细胞向Th1、Th2转化或Th1细胞与Th2细胞之间发生转化[15]。Th1细胞主要分泌促炎性细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-1β，而Th2细胞则主要分泌抗炎性细胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-6和IL-13[16]。其中IL-4对Th0细胞分化为Th1和Th2起关键性调控作用。IL-4在高水平时Th0细胞主要分化为Th2细胞， IL-4缺乏时IFN-γ能够促进Th0细胞分化为Th1细胞。此外，Th1分泌的IFN-γ和Th2分泌的IL-4，不仅可以促进自身分泌细胞的成熟，还可以抑制对方的分化[15]。当机体处于正常状态时，Th1/Th2细胞处于平衡状态，故IFN-γ/IL-4平衡一定程度上能够反映Th1/Th2平衡状态。在本研究中DTH组发生了Th1极化，炎性细胞因子分泌增加，小檗碱处理则抑制Th1反应，表现为足垫组织炎性因子IFN-γ、TNF-α减少，脾脏单个核细胞ConA刺激实验IFN-γ分泌降低，小檗碱能够降低OVA刺激脾脏单个核细胞IFN-γ的分泌水平，而对IL-4无明显影响。

总而言之，小檗碱在OVA诱导的DTH模型中发挥抗炎作用，其可能的作用机制是小檗碱抑制Th1细胞介导的免疫反应，使 Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)平衡恢复，从而减缓DTH炎症反应。然而是否存在其他相关反应及作用机制，有待进一步实验探讨。