参麦注射液对高血压心衰大鼠粪便代谢组学的影响*

钟森杰，李 静，邱 宏，程 彬，胡志希，李 琳

(湖南中医药大学中医诊断研究所，长沙 410208)

参麦注射液是治疗心脑血管疾病的常用中药制剂，其主要成分为红参和麦冬的提取液。本课题组前期研究结果表明，参麦注射液对高血压心衰大鼠的疗效显著，能有效改善动物模型的心功能指标及心肌细胞结构，表现出多靶点的作用特点[1-2]。粪便代谢产物是肠道菌群和宿主共同代谢的结果，多项研究发现，肠道菌群及其代谢产物与高血压、心衰等心血管疾病有着广泛联系，使得从粪便代谢产物中筛选生物标志物用于心血管疾病的诊断、生物靶向治疗、预后监测等成为可能[3-5]。本研究紧扣前沿热点，运用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)的非靶向代谢组学技术，研究参麦注射液对高血压心衰模型粪便代谢组学的影响，从生物学角度进一步阐明疾病的生物学基础及药物的干预机理。

1 材料

1.1 动物

雄性6周龄Dahl盐敏感大鼠20只，体质量(220±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2016-0006，饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF级实验室。本实验已通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会审查(伦理学批号20170906)。

1.2 主要仪器

ACQUITY型液相色谱仪、Xevo G2-XS QTof型质谱仪(沃特世科技(上海)有限公司)；JXFSTPRP-24/32型样品研磨仪(上海净信实业发展有限公司)；CODA型型智能大鼠血压计(美国Kent Scientific公司)；SB-5200DT型超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)；TYXH-I型漩涡振荡器(上海汗诺仪器公司)；SonoScape-S2N型实验动物彩超仪(深圳开立科技公司)；TGL-16MS型低温离心机(上海卢湘仪仪器有限公司)。

1.3 主要试剂与药物

本研究所用试剂由上海鹿明生物科技有限公司提供，具体批号及产家信息如下：L-2-氯苯丙氨酸(批号103616-89-3,上海恒创生物科技公司)；甲醇(批号CAEQ-4-003302-4000)、甲酸(批号CAEQ-4-00303-0050)、乙腈(批号CAEQ-4-00306-4000，均为上海安谱实验科技有限公司)。参麦注射液(规格：20 mL/瓶，批准文号：国药准字Z53021720，批号20190801，云南植物药业有限公司)。

2 方法

2.1 模型制备

所用造模方法参考本课题组的前期报道[1-2]。所有大鼠给予普通饲料(0.3%NaCl浓度)适应喂养7 d后，按随机数字表法分为正常组(6只)、模型组(7只)和参麦注射液组(7只)。正常组继续给予普通饲料饲养，模型组、参麦注射液组给予高盐饲料(8%NaCl浓度)，每只每天饲料20 g，饮水量不限，共20周。饲养期间每2周检测1次鼠尾血压，以收缩压高于140 mmHg为高血压病的成模判定依据。饲养结束后对3组大鼠进行超声心动图检查及血清NT-proBNP含量检测，以左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)与左室短轴缩短率(fraction shortening,FS)显著降低、NT-proBNP值显著上升为心衰模型的判定依据。

2.2 分组给药

造模结束后对参麦注射液组大鼠进行药物干预。依据人与实验动物的等效剂量换算，药物的单次给药剂量为6.0 mL/kg，腹腔注射每天1次共15 d。模型组注射同等剂量的灭菌注射用水。给药结束后，对参麦注射液组和模型组大鼠进行超声心动图检查及血清NT-proBNP含量检测以观察疗效。

2.3 粪便样本预处理

给药结束后，运用粪便收集管收集各组大鼠的粪便样本，保存于-80 ℃冰箱。上机检测前对粪便样本进行预处理，步骤如下：(1)取60 mg样本，添加内标(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL；C-17，0.01 mg/mL)各20 μL和600 μL的甲醇∶水(V∶V=4∶1)；(2)加入2个小钢珠，-20 ℃静置2 min，加入研磨机中研磨(60 Hz，2min)；(3)超声提取10 min，-20 ℃静置30 min；(4)4℃12000 r/min离心10 min，取200 μL上清液，利用有机相针孔过滤器进行过滤，移至进样瓶进行LC-MS上机检测。

2.4 LC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱条件为ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7um)，柱温维持在45 ℃；流动相：A-水、B-乙腈(均含0.1%甲酸)；流速保持0.4 mL/min，进样体积5 μL。质谱条件：离子源：ESI；样本的质谱信息收集运用正负离子扫描模式，正离子模式毛细管电压设置为3kv，负离子模式设置为-2kv。

2.5 数据预处理

经LC-MS分析后获得原始数据，运用Progenesis QI v2.3程序对原始数据进行处理，包括基线过滤、峰识别与对齐、保留时间校正等。将正负离子数据合并，得到包括保留时间、离子模式和质核比等信息的数据矩阵用以后续分析。代谢物的鉴定基于精确质量数、二级碎片以及同位素分布，使用 HMDB数据库(The Human Metabolome Database)、Lipidmaps(v2.3)以及Metlin数据库(http://metlin.scripps.edu)进行代谢物的鉴定分析。

2.6 统计学方法

将数据矩阵导入SIMCA14.0软件进行主成分分析(principle component analysis,PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least square discriminant analysis,PLS-DA)，获得对应的得分图以区分各组间代谢轮廓的总体差异。差异代谢物的鉴定采用正交-偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least square discriminant analysis,OPLS-DA)，以OPLS-DA模型的变量重要性值(variable important in projection,VIP)大于1.2为条件，挖掘具有较强解释能力的差异代谢物，并结合SPSS 22.0统计软件的t检验结果，以验证组间差异代谢物是否具有显著性。组间比较方式：模型组vs正常组、参麦注射液组vs模型组，选择2组比较方式的共同差异变量。

3 结果

3.1 各组大鼠疗效观察结果

喂养20周后，模型组和参麦注射液组14只大鼠均成高血压心衰模型，可用于后续药物干预研究。经参麦注射液干预15 d后，与模型组比较参麦注射液组大鼠的LVEF值和FS值明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；NT-proBNP值明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)(见图1)。

与模型组比较：**P<0.01图1 药物干预后大鼠LVEF、FS和NT-proBNP比较

3.2 各组大鼠基峰图结果

LC-MS上机分析后将每个时间点质谱图中最强的离子强度连续描绘并绘制基峰图(base peak chromatogram，BPC)。图2示，在正负离子模式下，3组大鼠的BPC。

图2 正常组、模型组和参麦注射液组基峰图(BPC)

3.3 各组大鼠PCA和PLS-DA分析结果

PCA得分图可直观观察样本间的总体分布趋势，判断可能存在的离散点；PLS-DA得分图可直观观察样本的分类效果和聚集程度。图3示，正常组、模型组和参麦注射液组所有样本点均位于95%置信区间内，3组在空间分布上完全分开且无交叉和重叠，分离程度好；图4示，PLS-DA得分图所有样本点均位于95%置信区间内，3组的样本点相互分开且互不重叠，组内聚集效果好，组间分离趋势明显，分类效果显著。

注：EK为空白组(绿点)，EM为模型组(蓝点)，ES为参麦注射液组(红点)图3 正常组、模型组和参麦注射液组大鼠偏最小二乘判别分析(PCA)得分图

注：EK为空白组(绿点)，EM为模型组(蓝点)，ES为参麦注射液组(红点)图4 正常组、模型组和参麦注射液组大鼠偏最小二乘判别分析(PCA)得分图

3.4 各组大鼠差异代谢物筛选结果

为探求对分组贡献较大的变量，以OPLS-DA模型中的分类重要性值VIP为筛选条件，鉴定出各组间有显著差异的代谢物。以模型组大鼠出现紊乱的代谢物作为潜在药物靶点，观察参麦注射液干预后的代谢物变化情况。表1示，与模型组比较，参麦注射液组中神经氨酸、别石胆酸、丙氨酰色氨酸、3,9-十六碳二烯酸、N-棕榈酰酪氨酸、亚油基肉碱、3-羟基-顺式-5-十四碳酰肉碱等7种代谢物表达水平显著回调(P<0.05)，谷氨酸、牛磺脱氧胆酸、粪甾烷酸、二十二碳六烯酸等4种代谢物表达水平呈回调趋势。

4 讨论

衰竭心脏的主要代谢特征在于产能底物利用的转变，即由脂肪酸供能向糖类、氨基酸、酮体等物质供能转变，此时氨基酸成为心脏产能的替代底物，故可见模型大鼠出现谷氨酸等氨基酸类物质水平紊乱[6-7]。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，氨基酸的异常直接影响蛋白质的合成，同时心脏结构与功能的损伤亦可扰动蛋白质代谢，体现为蛋白质水解的多肽类中间产物丙氨酰色氨酸水平紊乱。产能底物转移是心衰发生发展的病理环节，但长期的底物转移难以为心脏供给充足的能量，因此产能底物正常化成为治疗关键[8]。本次研究结果表明，高血压心衰病理过程中伴随着氨基酸及其衍生产物的水平改变，参麦注射液可促使上述物质水平趋于正常化，从而优化衰竭心脏的能量供应。

肉碱是促进脂肪酸氧化成能量的关键物质，其广泛存在于生物体内，其中心肌细胞线粒体较为丰富。细胞骨架影响着线粒体的结构，心肌结构改变可损伤细胞骨架，同时心衰时的多方面病理性因素都可引发线粒体的功能障碍[9]。线粒体损伤是衰竭心脏能量代谢障碍的核心，结构与功能改变必然导致模型大鼠的亚油基肉碱、3-羟基-顺式-5-十四碳酰肉碱表达异常，致使能量合成途径受抑制。随着参麦注射液干预作用显现，线粒体结构与功能逐步改善，心肌能量合成得以恢复，肉碱类物质水平回调。

前期运用气相色谱-质谱联用技术发现，高血压心衰大鼠血液中的胆固醇水平上升[10]。胆固醇在肝细胞中可合成胆酸、鹅脱氧胆酸和次级胆汁酸等物质，经肠道微生物分解后生成少量石胆酸和脱氧胆酸，其与胆汁酸代谢存在密切关联[11]。胆汁酸归属“肠-肝循环”系统，可于肠道中转运脂类，胆汁酸的形成是促进血液中胆固醇清除的重要途径。体内胆固醇堆积过多，肝细胞功能受损，引发胆汁酸“肠-肝循环”障碍，因此可见模型大鼠粪便中的别石胆酸、牛磺脱氧胆酸、粪甾烷酸水平紊乱。经参麦注射液干预后，经由粪便排出的胆汁酸类物质表达回调，提示药物通过调控胆汁酸代谢以清除体内过多的胆固醇，调节脂质堆积。

表1 组间差异代谢物筛选结果比较

3,9-十六碳二烯酸、二十二碳六烯酸均属于不饱和脂肪酸，异常的不饱和脂肪酸代谢是众多心血管疾病的潜在生物标志物[12-13]。由肠道微生物代谢生成的脂肪酸可经由G蛋白偶联受体进入体内，从而参与生物体的脂代谢紊乱过程。参麦注射液通过回调不饱和脂肪酸的异常表达，可促使胆固醇酯化，降低血液中胆固醇和甘油三脂含量，继而发挥对心脏等靶器官的保护效应[14]。

神经氨酸是丙酮酸和N-乙酰氨基甘露糖的醇醛缩合产物，一般不以游离形式存在，该物质在心衰模型中的异常表达机制仍有待进一步探讨。值得注意的是，肉碱类、3,9-十六碳二烯酸、二十二碳六烯酸等物质主要来源于膳食补充，如二十二碳六烯酸在生物体内虽可经α-亚麻酸代谢生成，但生成量甚少，难以满足机体需求。结合前文的胆汁酸“肠-肝循环”障碍，这部分紊乱的物质提示模型存在肠道稳态失衡，而对肠道功能的调节可能是参麦注射液治疗高血压心衰的有效靶点，其具体机制有待更为深入的研究。

本研究以粪便代谢组学为切入点，发现参麦注射液通过调控氨基酸及其衍生产物、肉碱类物质水平以优化能量代谢，这将有助于改善心功能，延缓心衰进展，与前期结果存在共性[15-16]；另一方面可通过调节胆汁酸代谢、不饱和脂肪酸代谢以改善体内的脂代谢紊乱。综上所述，参麦注射液干预高血压心衰的机制涉及优化氨基酸代谢、蛋白质代谢、肉碱代谢、胆汁酸代谢、脂质代谢等多个层面，在后续研究中可结合肠道微生态及靶向代谢组学等研究方法，深入阐明心衰与肠道微生态之间的联系，以期获得更为丰富的结果。