姜黄素通过调控Wnt通路改善牙周膜干细胞成骨分化能力

吕威 王鹤丹 苑春丽

牙周组织的修复与再生的相关研究一直都是口腔领域的研究热点[1-2]。人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是一类具有干性和成骨分化的潜能的多功能干细胞，是牙周骨缺损修复的重要细胞群，同时其易于分离与培养，是牙周骨再生最可靠的细胞来源[3]。此外，研究发现牙周炎会激活经典的Wnt信号通路，进而下调成骨相关的关键基因表达(包括ALP、OCN以及Runx2等)，抑制PDLCs的成骨分化能力。

姜黄素是一种从姜科、天南星科植物的根茎中提取的一种二酮类化合物，易溶于有机溶剂，具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用[4-5]。研究发现姜黄素能显著下调Wnt通路相关蛋白质β-catenin的表达，进而抑制乳腺癌的进展。近年来，越来越多的研究表明，姜黄素的抗肿瘤作用是通过抑制Wnt相关信号通路而实现的[6-8]，包括宫颈癌和肺癌等，但是关于姜黄素能否也通过调控Wnt通路来改善人牙周膜干细胞的成骨分化能力尚不明确。本研究探索了姜黄素对人牙周膜干细胞增殖能力及成骨分化能力的影响，并进一步阐明其具体的作用机制，以期望为牙周骨缺损修复的治疗开辟新道路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(Amresco公司，美国)；L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素(Gibco公司，美国)；α-MEM培养液；qPCR RT Master Mix、SYBR®Premix EX TaqTMⅡ(Takara公司，日本)；碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成); 紫外线分光光度仪(Ep- pendorf，德国); CO2孵箱(Heraeus，德国)。

1.2 PDLSCs 分离和培养

收集因正畸减数或阻生新鲜拔除的健康第三磨牙或第一前磨牙， 牙齿拔出后立即用PBS溶液冲洗3 遍，再用无菌的锐利刀片刮取根中1/3区域的牙周膜组织，并剪成1 mm3大小的组织块。离心后，加入I型胶原酶2 mL， 并置于37 ℃培养箱内消化。15 min后，用培养基终止消化并离心，将组织块以1 mm间距平整放于6孔板中，上置盖玻片，滴加含 100 mL/L FBS 的α-MEM培养液， 37 ℃、 50% CO2、饱和湿度条件下培养。每隔3 d换液，待细胞从组织块边缘爬出并生长汇合达80% 时，用0.25%的胰酶进行消化，按1 ∶2或1 ∶3的比例传代，实验选用4～6 代的细胞。

1.3 CCK-8实验评估PDLSCs的增殖能力

将处于对数生长期的PDLSCs细胞接种于96孔板上，将细胞分为实验组和对照组。 24 h后，对照组细胞加入100 μL不含姜黄素的培养基，而实验组细胞则加入含40 μmol/L姜黄素的细胞培养基。分别于培养1、 2、 3、 4、 5、 6 d各时间点取出各组细胞，去除原有的培养基，再加入含10 μL CCK-8溶液的细胞培养基，继续孵育2 h。最后，用酶标仪(Bio-Tek, Winooski, VT，美国) 测定每个测量孔在450 nm处吸光度，并记录结果进行对比分析。

1.4 ALP 活性的测定

取经含或不含姜黄素的细胞培养及对PDLSCs细胞进行1 周处理后，吸去培养液，PBS 冲洗后，按碱性磷酸酶测定试剂盒说明进行操作，最后用酶联仪检测各孔520 nm波长处的吸光度值(A值)。

1.5 实时荧光定量RT-qPCR实验

根据说明书，通过Trizol试剂进行细胞内总RNA的提取，将500 ng的RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板按照SYBR Green I法进行目的基因的荧光定量PCR反应。qPCR 反应条件: 预变性，95 ℃、30 s，1 Cycle; PCR 反应， 95 ℃、 5 s， 60 ℃、 20 s， 40 Cycles; 融解曲线分析， 95 ℃、 0 s， 65 ℃、15 s， 95 ℃、0 s。此外，本研究的引物序列如表 1所示。

1.6 茜素红染色

收集成骨诱导培养21 d的各组PDLSCs，多聚甲醛(4%)固定10 min， 茜素红染色。将处理后的6 孔板置于倒置显微镜下观察其矿化结节拍照，Image-Pro Plus 图像处理软件进行矿化结节定量分析。

表 1 引物序列

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 姜黄素对PDLCs增殖能力的影响

CCK-8实验结果显示实验组的hPDLCs在加入40 μmol/L的姜黄素共培养后，所有时间点的细胞增殖能力均较对照组细胞有所升高，但差异没有统计学意义(图 1)。

2.2 姜黄素对PDLSCs成骨分化能力的影响

药物诱导1 周后， 分别收集实验组和对照组的细胞进行实时定量RT-qPCR实验，结果显示加入姜黄素后，实验组中的成骨相关基因ALP、OCN以及Runx2的mRNA表达水平均明显升高(图 2)。此外，实验组的细胞内ALP活性明显高于对照组(图 3)。也就是说，姜黄素对PDLSCs成骨分化能力有促进作用。

图 1 姜黄素对PDLCs增殖能力的影响

图 2 姜黄素对PDLSCs成骨相关基因表达的影响

图 3 姜黄素对PDLSCs的ALP活性的影响

2.3 姜黄素对Wnt信号相关信号通路的影响

RT-qPCR技术检测姜黄素对PDLSCs细胞内经典Wnt通路相关基因的表达水平进行检测。结果显示，姜黄素能显著下调Wnt通路相关基因c-myc和β-catenin(图 4)。此外，在经姜黄素处理后的PDLSCs细胞株中加入氯化锂后，PDLSCs成骨分化能力会有所下调(图 4)。这一致说明了姜黄素引起的PDLSCs成骨分化能力增强是通过抑制细胞内的Wnt通路起作用的。

2.4 姜黄素对PDLSCs钙化结节形成的影响

茜素红矿化结节染色实验发现与对照组相比较，经姜黄素处理可以明显提高PDLSCs钙化结节的形成量。当在实验组中加入Wnt通路激动剂(氯化锂)，PDLSCs钙化结节的形成量明显减少(图 5)。说明姜黄素可以通过调控Wnt通路发挥促PDLSCs成骨分化的作用。

图 4 姜黄素对Wnt信号通路相关基因表达的影响

图 5 姜黄素对PDLSCs矿化结节形成量的影响

3 讨 论

牙周炎是由细菌引起的牙周组织慢性进行性炎症反应，其最严重的并发症是导致患者的牙齿丧失，而人牙周膜干细胞(PDLSCs)是修复牙周缺损的关键细胞[9]。牙周膜干细胞是从牙周组织中分离培养而形成的成体干细胞，具有多向分化潜能[10-11]。但是，对于牙周炎患者而言，牙周膜干细胞的成骨分化能力会被显著抑制。因此，探索能改善牙周炎患者牙周膜干细胞成骨分化能力的药物并阐明其作用机制是近年来牙周组织修复与再生研究的热点。

姜黄素是一种天然多酚，主要来源于中药姜黄、莪术等植物，具有毒性小、价格便宜、易提取等优势。姜黄素药理学作用广泛，具有抗炎、抗纤维化及促成骨分化等多种生物学效应。大量研究表明，姜黄素可以抑制破骨细胞的活性，促进骨的重建，缓解各种不同原因所致的骨质疏松[12-13]。同样地，在本研究中，我们通过RT-qPCR技术也发现经姜黄素处理后，可以明显上调PDLSCs的成骨分化相关基因(ALP、OCN以及Runx2)的表达水平，提高ALP的活性以及钙化结节的形成量。但是，结果显示姜黄素并不影响PDLSCs的增殖能力。总的来说，姜黄素能显著改善PDLSCs细胞的成骨分化能力，但具体的作用机制尚不明确。

既往研究发现，多个细胞因子、生长因子信号通路的调控，包括BMP、Wnt、Notch、FGF、PI3K/Akt 等信号通路会影响成骨分化关键基因的表达与功能，在调控牙周膜干细胞成骨分化过程起到重要的作用[14-15]。在牙周膜干细胞成骨分化过程中的研究较多为 Wnt 经典信号通路，它在调控细胞的增殖、成骨分化中起着重要作用。廖海清等[16]发现阻断经典Wnt/β-catenin信号通路将会显著减低ALP的活性，并显著减少矿化结节的形成量，进而抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力。有趣的是，研究发现姜黄素能通过调控Wnt相关信号通路抑制多种肿瘤进展，包括乳腺癌、肝癌等。因此，本研究提出假设：姜黄素有可能是通过阻断Wnt信号通路来发挥促牙周膜干细胞成骨分化作用。本研究中，发现姜黄素的确能抑制Wnt信号通路关键基因c-myc和β-catenin的表达；同时，对经姜黄素处理后的PDLSCs中加入Wnt通路激动剂，PDLSCs的成骨分化能力会被明显抑制。

本研究表明姜黄素能通过抑制Wnt相关信号通路的激活，促进 PDLSCs 向成骨细胞分化，这为其应用于修复牙周骨缺损提供了科学依据。