冷冻电子显微镜观察人釉原蛋白的自组装

赖婷婷 陈亮 张川 田鲲

牙釉质作为最坚硬、最精密的硬组织，其形成过程复杂，需基因表达，细胞分泌，蛋白及酶调控等共同作用，构建从分子、纳米至宏观均高度有序的结构。该过程最重要最基础的是釉原蛋白发生一系列自组装反应形成纳米球，搭建起釉质细胞外基质最基本的结构实体，再进一步聚集成高级构象作为有机模板，指导羟基磷灰石晶体有序地成核与伸长[1]。釉原蛋白(amelogenin)是釉质形成初期最主要的细胞外基质，占90%[1]，在体外能自组装成直径16～70 nm的纳米球[2]。通过原子力显微镜[3]、小角度X线散射(SAXS)[4]、核磁共振[5]、动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)[6]等的研究，纳米球结构已被广泛认可。随着牙釉质矿化成熟，釉原蛋白逐渐降解、消失，即表现为在牙胚发育早期高度表达，晚期及已矿化期低表达甚至无表达。

釉原蛋白的自组装过程发生在水性环境中，若进行常规脱水会导致蛋白结构明显改变。冷冻电子显微镜能将蛋白样品迅速冷却至玻璃态冰[7]，镜下结构基本反映冷却前的瞬时状态，最大程度减少了脱水伪影，且需要的样品量少[7]。因此，本实验采用冷冻电子显微镜来观察人釉原蛋白在体外的自组装过程，初步探究釉原蛋白的自组装机制，为体外修复缺损釉质提供思路。

1 材料与方法

完整取出青少年下颌第三磨牙牙囊(处于釉质发育期)1 例(四川省人民医院口腔正畸科)， InvitrogenTMTRIZOL®试剂(赛默飞世尔，美国)提取牙胚细胞总RNA,根据 Gen Bank 公布的人釉原蛋白全长序列(Genebank M86932)，利用 Primer Premier 5 生物学软件分析并设计特异性引物，引入酶切位点 Bam H I 和 Sac I。引物由上海生工生物公司合成，引物序列如表 1，划线为酶切位点。逆转录合成cDNA链,通过聚合酶链反应(PCR)扩增釉原蛋白基因全长序列，并回收、克隆、筛选及鉴定(图 1)。与pMD19-T原核表达载体构建重组质粒，采用过热激法再将质粒转入原核表达菌株宿主菌E.coliTop10 中培养(图 2)，A600值为0.6时，以0.3 mmol/L异丙基-β- D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达、纯化，电泳检测(图 3)。透析法调pH为3.5，冷冻干燥保存。

在冰上用pH为3.5的超纯水溶解釉原蛋白冻干粉， 4 ℃放置24 h，确保蛋白质完全溶解。滴入4 mmol/L pH=8.0的PBS液，使蛋白液pH值从3.5跃升至8.0，蛋白最终质量浓度为0.1 mg/mL。在自组装发生1、 10、 20 min 时终止反应，观察组装情况。将20～50 μL的蛋白溶液滴至铜网多孔碳侧，冻干后将铜网置于cryo TEM(Tecnai F20 TEM型，FEI公司，美国)下观察。

表 1 釉原蛋白全长引物

M: MD2000 Marker; AM:人釉原蛋白

2 结 果

冷冻电子显微镜观察人釉原蛋白在1、 10、 20 min 的自组装状态(图 4)。当pH从3.5迅速提升至8，随时间递增，蛋白形态、结构逐渐变化：由最初的低聚体到纳米小球，最终形成网状蛋白框架链。该过程是复杂、循序渐进的，两个单体叠加成二聚体，进一步团聚成六聚体，八聚体等大小不同形状不同的团聚物[8]。

M: MD2000 Marker; 1: pMD19-T-Am PCR产物

M： Protein maker; 1： 无 IPTG(None IPTG); 2： 0.1 mmol/L IPTG; 3： 0.2 mmol/L IPTG; 4： 0.3 mmol/L IPTG; 5： 0.4 mmol/L IPTG; 6、 7： 诱导前(Before induction); 8、 9： 0.3 mmol/L IPTG诱导后(after 0.3 mmol/L IPTG induction)

随着聚集体数目的增加、相互融合，出现更大分子量的多聚体与纳米球，而纳米球串联形成纳米带，纳米带纵横交错形成大面积的网状蛋白支架。在1 min时主要观察到蛋白分子的低级结构——低聚体(图 4左)。蛋白的组装并非同时进行，同一视野既有单个小体积球体(图 5A)，也有L型(图 5B)、蝴蝶夹状(图 5C)的四聚体等，体积均相对较小，最长轴直径 10～40 nm不等，此时发生自组装的蛋白也较少。10 min时自组装蛋白明显增多，体积增大(图 4中)，低聚体出现环状或纵向延伸，呈花瓣状(图 5D、 5E)、带状(图 5F),同时出现较多的纳米球，约20～30 mm(图 5G)，甚至聚集成直径约80 nm的巨大的蛋白分子(图 5H)。 20 min时，蛋白的组装趋于成熟，小体积的多聚体较少，蛋白在空间三维方向上的延伸明显(图 4右),有类似锥体型的结构(图 5I)，体积明显变大，形成网状结构(图 5J)。

图 4 釉原蛋白的自组装过程

1 min(A: 小体积球体; B： L型四聚体； C： 蝴蝶夹状的四聚体； D： 小花瓣状); 10 min(E：大花瓣状； F： 带状； G： 纳米球； H： 不规则巨大蛋白分子); 20 min(I： 锥体型； J： 蛋白网)

3 讨 论

釉原蛋白的结构与功能紧密协作、不可分割。人釉原蛋白由三个不同亚单位组成：N 端具有45 个氨基酸，酪氨酸的含量高，又称TRAP (tyrosine-rich amelogenin peptide)；中央段具有疏水性，由Xxx-Yyy-Pro重复序列构成(X和Y主要是谷氨酰胺；P，脯氨酸)，变异性大，不同物种氨基酸序列重复单元长度不同；C 端较短，具有亲水性，富含亮氨酸。Fukae等[9]提出核-壳模型：中性的N端和中央段形成纳米球的致密核心，负极域(C端)暴露于溶液中，形成疏松带负电荷的壳。适宜条件下，负电荷壳产生排斥力防止纳米球之间相互聚集，调节纳米球大小。此外，C端还参与羟基磷灰石表面的附着，而N端和中央段主要影响蛋白质之间的相互作用[10]。釉原蛋白的亲疏水性，使其在生理条件下微溶于水，呈固态或半固态，易聚集形成团聚物，也为自组装创造了条件。釉原蛋白转录时还可出现RNA 的选择性剪切，产生富含主要功能区的异构体蛋白片段——LRAP(leucine-rich amelogenin peptide)，其也可自发组装成纳米球[11]。

釉原蛋白作为釉质形成过程中主要的功能性蛋白，属于内在无序化结构蛋白(intrinsically disordered/unstructured protein family，IDPs)。Goto等[12]研究猪的釉原蛋白认为不同蛋白区域有相应的二级结构，N端 (TRAP) 为 β-sheet；中央段富含展开的聚脯氨酸 II 或 β-turn，如 β- 螺旋；C 末端为不规则螺旋。IDPs构象不稳定，常以非折叠状态存在，与不同分子相互作用时转变不同的结构，适宜条件时趋于自组装成纳米球，可以解释图中观察到的大小不等、形态各异的低聚体、多聚体等。釉原蛋白的自组装受多种因素影响， 包括蛋白质浓度，温度，pH和离子强度等[13]。本实验最先观察到是直径约10 nm的低聚体(图 3A)，与实验[14]提到的3～10 mm大小一致。但未见明显的单体——直径小于3 nm的细长结构，猜测釉原蛋白强烈依赖pH，当pH从3跃升至8，触发了釉原蛋白构象从无序状态到折叠状态，自组装开始，单体迅速消耗聚集成低聚体。低pH时易观察到单体，如pH=4.4,单体及单体链占主体[13]，在酸性溶液中单体呈不对称的狭长杆状或椭圆形[15]；低聚体形成后由釉原蛋白N段诱导，中央段通过质子化作用参与纳米球的形成，C端对聚合反应的作用较小，主要抑制聚合体尺寸过大[16-17]。纳米球形成后，表面暴露多个氨基酸序列(如 ATMP 模体：PYPSYGYEPMGGW)，由于该实验中缺少非釉原蛋白等物质，不能进一步组装成超分子集团[18]，纳米球大小仅20～30 mm。现暂无足够证据表明纳米球形态为扁圆形或球形，但倾向于纳米球不是均质的,是低聚体围绕球体空心性排列，呈甜甜圈状[3，19]。本实验图3 DE可能是低聚体正环聚成纳米球的过程。 20 min时观察到的网状蛋白链(图3J)为非典型的单一轴向蛋白链，因为本实验中蛋白浓度足够(0.1 mg/ml)，溶液中任一空间点均可发生自组装，同时由于缺乏非釉原蛋白，如成釉蛋白(ameloblastin)，釉蛋白(enamelin)，蛋白酶以及生长因子类物质等的参与，无法完全模拟体内自组装环境，最终呈现出较散乱的链状结构。当然，冷冻电子显微镜是对三维结构的二维投射，观察到的平面结构可能与真实结构存在偏差，若需验证低聚物、纳米球、蛋白链确切的空间结构及功能，有待进一步探索。

虽然釉原蛋白的自组装过程已基本达成共识，Moradianoldak实验发现[20],纳米球并非刚性结构，吸附在不同疏水性或不同电荷的表面会解组装，猜测最终是低聚体亚基在釉原蛋白-矿物质接触面发挥作用，低聚体才是诱导釉质形成的功能实体。体外已很好地证明了釉原蛋白的逐步分级自组装，而体内是相当复杂的过程，需综合考虑矿物质、其他蛋白质、分子间亲疏水性等影响装配过程的各因素。现如今，牙釉质的仿生矿化被广泛研究，除釉原蛋白外，有多肽、细胞外基质类似物、聚酰胺-胺型树枝状分子及壳聚糖等不断被提出[21]，但进一步弄清釉原蛋白自组装机制及功能实体，才是研究新材料及开发新疗法修复和再生牙体硬组织的基础与关键。