ISO对大鼠正畸牙移动效果及牙周组织中Runx2、 ODF水平的影响

杨烁 燕玉敏

1. 274300菏泽, 单县中心医院口腔内科； 2. 滨州市中医院口腔科

随着人们生活水平的提高，对正畸的需求也不断扩大。正畸治疗是通过移动牙齿矫正错畸形，这一过程包括受正畸力的牙槽骨和牙周膜组织改建[1]。牙移动伴随根吸收作为正畸常见的并发症，其发生概率可达3%～100%[2]。因此，提高矫正效率的同时保持矫正后的稳定性显得尤为重要。异丙肾上腺素(isoprenaline, ISO)是β肾上腺素受体激动剂，有研究表明，交感神经系统可调节破骨细胞和成骨细胞的活动，在骨的生理和病理变化中起到重要作用[3]。本研究通过大鼠正畸牙移动模型的建立，探讨ISO对大鼠正畸牙移动效果及Runt相关转录因子(Runt-related transcription factor 2， Runx2)、 破骨细胞分化因子(Osteoclast differentiation factor， ODF)水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

盐酸异丙肾上腺素、戊巴比妥钠(西格玛奥德里奇中国有限公司)；EDTA脱钙液(上海舜百生物)；抗酒石酸酸性磷酸酯酶试剂盒、辣根过氧化物酶显色试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；镍钛拉簧(杭州新齿科材料有限公司)；正畸测力计(杭州奥索医疗器械有限公司); 游标卡尺(广州仪表仪器有限公司)；显微镜(Olympus，日本)；Runx2、ODF抗体(Abcam公司)。

1.2 实验动物

8 周龄SPF级SD雌性大鼠40只(购自华东师范大学，使用许可证号SYXK(沪)2015-0025)，体重约(200±20) g，自由饮食、饮水，温度(25±1) ℃，湿度(60±10)%。

1.3 动物模型的建立和治疗方法

1%戊巴比妥钠腹腔注射大鼠，待麻醉后于大鼠右上颌第一磨牙和切牙用快速涡轮机将固位沟磨出(深约1 mm)，在右上第一、二磨牙之间穿过正畸不锈钢结扎丝(约0.02 mm)，将镍钛拉簧一端固定，正畸测力计测出50 g弹簧力值的距离，将拉簧的另一端用不锈钢丝结扎固定于切牙的固位沟。每日检查并维持加力装置。按随机数字表法分成对照组和ISO组，各20 只。ISO组腹腔注射5 mg/(kg·d)的ISO，对照组给予等体积的生理盐水， 1 次/d， 连续给药21 d。

1.4 测量牙齿移动距离

分别于0、 7、 14、 21 d通过大鼠腹腔注射过量1%戊巴比妥钠(10 mg/100 g)处死大鼠(每组5 只)，剪下大鼠上颌颌骨，去除周围软组织，采用游标卡尺测定测量大鼠左上颌第一、二磨牙近中颊沟点间的距离，两数值差值为大鼠右上第一磨牙近中移动距离。

1.5 标本制作

分批处死2 组大鼠后，将右上颌第一磨牙及周围颌骨完整取出，置于4%多聚甲醛固定， 24 h后取出，于4 ℃的EDTA脱钙液中脱钙6 周，取出后梯度乙醇脱水，包埋，沿牙体长轴切片，厚度为3 μm。HE染色后，中性树胶封片，置于显微镜下观察并拍照。

1.6 破骨细胞数量计数

选择2 组不同时间点的切片各5 张，根据抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒进行TRAP染色，显微镜下观察并计数Howship陷窝内细胞核数量≥3、阳性的多核破骨细胞，取平均值。

1.7 免疫组化法检测Runx2和ODF水平

切片脱蜡，微波修复后置于pH=6的枸橼酸盐缓冲液中，取出后加入一抗， 4 ℃过夜，冲洗后加入二抗， 37 ℃ 30 min，冲洗后辣根过氧化物酶显色，苏木素复染，脱水后中性树胶封片，观察各组Runx2和ODF水平变化。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 2 组大鼠牙齿的移动距离

与加力前相比， 2 组大鼠的牙齿均明显移动，且ISO组大鼠不同时间的牙齿移动距离显著长于对照组(P<0.05)(表 1)。

表 1 2 组大鼠牙齿的移动距离比较

2.2 HE染色结果

ISO组在0 d (即对照组) 时牙周膜形态较好， 牙槽骨未见明显骨吸收，牙根两侧可见相同宽度的牙周膜；ISO组7、 14、 21 d压力侧可见破骨细胞，牙周膜变窄，牙槽骨表面存在骨吸收陷窝，张力侧可见牙周膜变宽(图 1)。

A： 0 d(对照组)； B～D： ISO组正畸开始第7、 14、 21 天

2.3 破骨细胞计数结果

2 组大鼠破骨细胞在0 d时数目较少， 7、 14 d和21 d 时2 组大鼠右上颌第一磨牙压力侧显示较多的破骨细胞，其中ISO组破骨细胞数目较对照组多，差异有统计学意义(P<0.05)(表 2)。

2.4 Runx2 和ODF表达水平

2 组大鼠牙周膜中Runx2表达水平明显升高，其中ISO组明显高于对照组(P<0.05)； 2 组大鼠牙周膜中ODF表达水平明显升高，其中ISO组明显低于对照组(P<0.05)(表 3)。

表 2 2 组大鼠破骨细胞数目

3 讨 论

表 3 2 组大鼠Runx2 和ODF表达水平

表 3 2 组大鼠Runx2 和ODF表达水平

分 组0 d7 d14 d21 dRunx2ODFRunx2ODFRunx2ODFRunx2ODF对照组21.01±0.4713.70±1.0122.82±0.2117.28±0.4523.89±0.2320.38±0.3125.01±0.3122.18±0.40ISO组21.01±0.4713.70±1.0123.39±0.2415.03±0.3025.73±0.2817.19±0.2227.79±0.4019.37±0.33t值0.0000.0003.0159.30311.35518.76512.28412.117P值1.0001.0000.0170.0000.0000.0000.0000.000

Runx2 是一种特异性的成骨标志物，在转录水平参与了骨组织的多种特异性蛋白调控，并在成骨细胞的生长、分化过程中起中要作用[7]。周璨等人的研究发现，在大鼠正畸过程中牙周组织的成骨细成牙骨质细胞以及成纤维细胞中存在Runx2的表达，并且参与了牙周组织的改建过程[8]。有研究显示，在Runx2缺失的小鼠骨骼细胞中，可能通过对ODF表达水平的调节参与形成破骨细胞[9]。ODF是破骨细胞抑制因子/骨保护素的一种配体，牙周组织细胞中ODF的表达与破骨细胞的分化程度密切相关[10]。为探讨ISO在大鼠正畸治疗过程中的作用机制，本研究检测了ISO作用后大鼠牙周组织中的Runx2和ODF的表达水平。结果显示，加力后两组大鼠牙周膜中Runx2表达水平明显升高、ODF表达水平明显升高，但 ISO组的Runx2表达水平高于对照组，ODF表达水平低于对照组，其可能原因是ISO通过促进牙周组织的Runx2、抑制ODF表达水平，抑制了正畸牙移动过程中破骨细胞的生成、活化和骨吸收这些关键步骤，影响了大鼠正畸牙的移动速度。

综上所述，异丙肾上腺素可促进大鼠正畸牙移动，并影响Runx2和ODF的表达水平。但在长期的正畸治疗过程中，ISO的安全性和有效性还有待进一步的研究。