高效液相色谱法测定蚁参蠲痹胶囊中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量

杨 曼 张菁菁 闫春风 董海荣▲

1.承德医学院，河北承德 067000；2.颈复康药业集团有限公司，河北承德 067000；3.河北省中药新辅料技术创新中心，河北承德 067000

蚁参蠲痹胶囊由颈复康药业集团有限公司生产，临床用于治疗类风湿性关节炎（中医辨证为脾肾两虚、寒湿瘀阻证）的常用中成药。处方由蚂蚁、人参、丹参等15 味中药组成，具有祛风除湿、补肾健脾、活血通络的功效[1]。丹参[2]为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，丹参酮类是其主要化学成分，具有良好的活血化瘀、祛瘀通络功效，且研究表明丹参酮类化合物具有良好的抗炎功能[3-6]，在治疗类风湿性关节炎中起重要的作用。蚁参蠲痹胶囊现行注册标准只建立了丹参酮ⅡA的含量测定方法，为了更加全面地控制药品质量，本实验建立高效液相色谱法同时测定制剂中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量，为更加全面地控制蚁参蠲痹胶囊质量提供科学的依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；MS204TS 电子分析天平（万分之一）；XSE205 电子分析天平（十万分之一）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

隐丹参酮（批号：110852-201807，供含量测定用）、丹参酮ⅡA（批号：110766-202022，供含量测定用），均购于中国食品药品检定研究院；丹参酮Ⅰ（批号：568-73-0，上海诗丹德标准技术服务有限公司，供含量测定用）；蚁参蠲痹胶囊（批号：920246B、020074、020261），为市售品；甲醇为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为自制纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent 5 TC-C18色谱柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.02%磷酸溶液（75∶25）；检测波长为270 nm；体积流量为1.0 mL/min；柱温25℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取三种丹参酮类对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为16、5、15 μg/mL 的对照品混合溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品内容物约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方中药味比例和制备工艺，制备缺丹参阴性样品，同“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液即得。

2.3 专属性试验

分别取对照品、供试品及阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，色谱图见图1，结果显示，阴性无干扰，该方法专属性良好。

图1 高效液相色谱法色谱图

2.4 线性关系考察

精密称取三成分对照品适量，置于同一棕色量瓶中，加甲醇制成每1 毫升含丹参酮ⅡA 200 μg、隐丹参酮200 μg、丹参酮Ⅰ50 μg 的混合对照品储备液。

分别精密量取上述混合对照品储备液4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mL于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得标准溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，以待测成分质量浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，结果详见表1。

表1 三种成分线性回归方程和线性范围

2.5 精密度试验

吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积，结果显示，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 的RSD分别为0.61%、0.29%、0.19%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

室温下取供试品溶液（批号：920246B），分别于0、2、4、6、8、12、24 h 测定目标成分峰面积，计算丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 的峰面积RSD分别为0.91%、0.43%、0.83%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批样品，按“2.2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，测得丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量对应的RSD分别为2.21%、0.74%、0.81%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称定已知含量的蚁参蠲痹胶囊内容物9 份，每份0.75 g，分别精密加入约相当于样品含量50%、100%、150%的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进液相分析，计算平均回收率及RSD值，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=9）

2.9 样品含量测定

取不同批号的样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定样品含量，结果详见表3。

表3 样品含量测定结果（n=2，mg/g）

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

在参照相关文献[7-15]后，考察不同体系及不同比例的流动相（乙腈-0.02%磷酸、甲醇-水、乙腈-1%醋酸及乙腈-甲醇-水），经比较采用流动相甲醇-0.02%磷酸（75∶25）等度洗脱时，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA 的分离效果最好。并对各指标成分进行紫外全波长扫描，结果显示，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮及丹参酮ⅡA 分别在248、268、270 nm 处有最大吸收，参考相关文献[16-18]并查阅《中华人民共和国药典》2020版一部[2]中丹参药材项下丹参酮类的含量测定，蚁参蠲痹胶囊中三个指标性成分在270 nm 处均有较大吸收，最终确定检测波长为270 nm。由于篇幅所限，该色谱条件优选过程前文并未全部列出。

3.2 方法学耐用性考察

考虑到所建立的方法应具有耐用性，对不同流速、不同柱温以及不同的色谱柱进行耐用性考察，结果显示，在流速为0.8、1.0、1.2 mL/min 下，各指标性成分分离效果均较好，分离度与RSD值均达到要求。在柱温为20、25、30℃下各指标性成分与相邻杂峰的分离度均较好，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA 含量测定的RSD值为3.97%、0.66%、2.74%，表明柱温对丹参酮Ⅰ的含量测定有一定影响，因此在含量测定过程中要严格控制柱温。依次考察了Agilent 5 TC-C18、Kromasil、Inertsil-ODS、YMC色谱柱，结果显示，四种色谱柱分离效果均较好；另外还发现，使用Agilent 5 TC-C18与YMC 色谱柱时丹参酮Ⅰ先于隐丹参酮出峰，而换为Kromasil 与Inertsil-ODS 色谱柱后，丹参酮Ⅰ与隐丹参酮的出峰顺序互换，由于篇幅所限，该方法学耐用性考察部分前文并未全部列出。

3.3 小结

本实验采用高效液相色谱法同时测定蚁参蠲痹胶囊中的丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量，经方法学研究，结果表明该方法重复性好，稳定性高，回收率好，专属性较强。本法操作简单、结果可靠，为更好地控制蚁参蠲痹胶囊质量提供参考。