胚胎发育动力学参数对囊胚移植周期妊娠结局的影响及预测模型建立

史艳彬 张婉妮 邵小光

大连市妇女儿童医疗中心生殖与遗传医学中心，辽宁大连 116000

尽管辅助生殖技术取得了重大进展，但体外受精-胚胎移植（in vitro fertility-embryo transfer，IVF-ET）面临的主要挑战仍然是选择最佳的单胚移植技术[1]。增强胚胎选择过程将使体外受精成功率最大化[2]。大量文献报道，在侵入性技术PGT-A 局限性的背景下，Time-lapse 技术作为以选择具有最高发展潜力的胚胎为目标来优化非侵入性技术方面展示了极大的优势[3-5]。本研究通过回顾性分析胚胎发育动力学指标与妊娠结局的关系，建立胚胎动力学指标预测囊胚移植后妊娠结局的模型，为临床工作提供理论基础，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年7月～2019年7月于大连市妇女儿童医疗中心生殖与遗传医学中心使用Time-lapse 囊胚培养并行囊胚移植的704个周期的资料，排除合并影响妊娠结局要素和移植两枚囊胚仅单胎妊娠的453个周期，共纳入251个周期的371个胚胎。根据妊娠结局，将其分为未妊娠组（A组，N=115个周期，n=169个胚胎）和临床妊娠组（B组，N=136个周期，n=202个胚胎）。本研究经过大连市妇女儿童医疗中心医学伦理委员会审核批准。

纳入标准：①年龄≤40岁；②不孕原因为女方输卵管因素、排卵障碍和男性精液因素；③夫妻未见染色体异常。排除标准：①补救显微受精；②移植日子宫内膜＜7 mm；③移植2 枚囊胚单胎妊娠；④宫腔因素（如息肉、粘连或黏膜下肌瘤）；⑤患有肥胖、生殖器畸形、高泌乳素血症、子宫内膜异位症、卵巢早衰、免疫性疾病；⑥患有高血压、糖尿病、肾病等内科合并症者。

1.2 方法

控制性超促排卵按大连市妇女儿童医疗中心常规进行（长方案或拮抗剂方案）。行体外受精-短时受精未补救患者的受精卵置于37℃、6% CO2、5% O2的Time-lapse 培养箱中（ESCO，Miri-TL），用一步培养液（GlobleRtotalRLP，美国）进行全程培养；分别于取卵后第5、6 天观察囊胚并评价（评价标准采取Gardner评分系统）。依据形态学指标选择三级或四级囊胚移植（CC 囊胚不用于移植）。

新鲜周期或冻融周期（HRT 方案）囊胚移植，移植时内膜厚度≥7 mm。囊胚移植12 d后检测血人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）判断妊娠。如妊娠，胚胎移植后28～35 d B超检查，确定临床妊娠及妊娠胎数。妊娠后继续使用雌孕激素维持妊娠，孕8～9 周可开始逐渐减量，孕12～14 周停药。

1.3 观察指标

观察胚胎发育动力学指标对妊娠结局的影响，探索影响囊胚移植周期临床妊娠结局的胚胎发育动力学指标，建立临床妊娠结局预测模型，并对其进行验证。

以雌雄原核消失的时间点为t0；t2、t3、t4、t5、t8：合子分裂为2细胞、3细胞、4细胞、5细胞、8 细胞的时间点；cc2：t3～t2；cc3：t5～t3；s2：t4～t3；s3：t8～t5；tM：桑椹胚形成的时间；tSB：囊胚开始形成的时间点；tB：囊胚完全形成的时间点。由一名胚胎师评估胚胎发育动力学指标。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。二元Logistic 回归分析把对妊娠结局有显著影响的胚胎动力学指标作为自变量，妊娠情况作为因变量，使用逐步回归法统计，以P≤0.05 为选入变量的标准，P≥0.10 为剔除变量的标准。采用Enter 法，建立体外受精囊胚移植临床妊娠率预测方程式，并通过接受者操作特征（ROC）曲线检验方程的有效性。

2 结果

2.1 两组胚胎发育动力学指标的比较

两组的t2、t3、t4、cc2、cc3、s2 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组的t5、t8、s3、tM、tSB、tB 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组胚胎发育动力学指标的比较（h，）

表1 两组胚胎发育动力学指标的比较（h，）

组别 周期数 t2 t3 t4 t5 t8 cc2 A组B组115 136 t值P值2.76±1.36 2.15±0.39 0.181 0.158 14.43±2.98 12.61±0.67 0.174 0.238 15.70±4.30 13.05±0.65 0.197 0.153 28.61±4.32 23.86±1.46 3.076 0.044 33.80±5.33 27.89±5.01 4.213 0.027 11.89±1.95 10.45±0.94 0.179 0.224组别 周期数 cc3 s2 s3 tM tSB tB A组B组t值P值115 136 14.37±1.93 11.58±1.38 2.167 0.080 1.25±2.96 0.39±0.24 0.119 0.500 5.05±3.29 1.41±0.55 5.935 0.010 78.84±5.32 66.48±6.56 10.179 0.000 87.48±5.99 74.16±5.82 6.373 0.000 105.21±5.50 86.39±6.16 8.154 0.000

2.2 建立临床妊娠结局相关动力学指标影响因素的预测模型

以妊娠结局为因变量（未妊娠=1，持续妊娠=2），以两组比较后差异有统计学意义的胚胎发育动力学指标（t5、t8、s3、tM、tSB、tB）为自变量，建立妊娠结局相关胚胎发育动力学指标的预测模型，根据表2中数据可得体外受精囊胚移植后妊娠结局相关胚胎发育动力学指标的预测模型：P=1/（1+y），y=-3.803+0.007×t5-0.004×t8-0.042×s3+0.023×tM+0.005×tSB+0.043×tB。

表2 临床妊娠结局相关动力学指标影响因素的回归模型

2.3 预测模型的敏感度和特异性

根据所得临床妊娠结局回归模型，计算临床妊娠率预测概率，并与实际妊娠结局数据绘制ROC曲线（图1），结果显示，曲线下面积为0.702 （95%CI：0.679～0.791，P=0.047），对应的敏感度为84.8%，特异性为88.9%，总正确率为86.70%。提示妊娠结局相关胚胎发育动力学指标的预测模型——y=-3.803+0.007×t5-0.004×t8-0.042×s3+0.023×tM+0.005×tSB+0.043×tB 有临床应用价值。

图1 预测模型的敏感度和特异性

3 讨论

人类胚胎学中的延时成像技术显示了胚胎独特的发育特征，通过胚胎发育事件的确切时间能够获得细胞周期长度和裂解模式[6]。已有文献证明，胚胎发育的速度与着床率有关[7]。移植特定发育速度的胚胎，最终患者的妊娠结局不尽相同[8-9]。这可能是由于胚胎的发育时间影响细胞周期的合成期（S期）持续时间；此外，染色体异常可能会延迟DNA 复制[10]，因此改变了细胞周期和分裂的长度。对预测胚胎发育和体外受精治疗结局预后因素的研究引起了学术界广泛的关注。目前，已有基于形态动力学参数的多种胚胎选择算法和妊娠结局的预测算法，但大多数关于动力学发育的人类胚胎研究都是基于在不同实验条件下产生的少量样本胚胎的生存能力与一系列严格调控的细胞事件有关，使用来自单个中心的数据很难被其他中心利用。此外，对于体外受精周期，卵子成熟度的不同会影响精子入卵的时间有差异，进而影响原核出现的时间。为了克服这些局限，本研究使用原核消失的时间点作为t0，利用胚胎发育的相对速度作为因变量，基于数据挖掘的模型具有较高的预测能力，可以有效地用于区分植入潜能增加的胚胎。

本研究的Logistic 回归分析显示，t5（OR=1.007，95%CI：1.001～1.013，P=0.000）、t8（OR=0.996，95%CI：0.941～1.054，P=0.012）、s3（OR=0.959，95%CI：0.821～1.120，P=0.000）是影响体外受精囊胚移植后妊娠结局的重要影响因素。这与Meseguer 等[11]（提出5 细胞期分裂及后期事件的发生时间是着床潜能的良好指标）以及Cruz等[12]（通过胚胎镜观察胚胎，提出5 细胞形成的时间和桑葚胚形成的时间是预测胚胎发展潜能更可靠的指标）的结论相一致。这些现象可能与人的胚胎从4～8 细胞阶段是人胚胎基因组激活的关键时期有关[13]。本研究中的tM（OR=1.023，95%CI：1.005～1.041，P=0.009）、tSB（OR=1.005，95%CI：1.001～1.009，P=0.000）、tB（OR=1.044，95%CI：1.002～1.088，P=0.000）也是妊娠结局的重要影响因素。最近的延时显微镜观察表明，致密化可能是人类胚胎活力的一个重要检查点，通过其，胚胎可以感觉到并消除染色体异常的卵裂球[14]。2013年，Campbell 等[15]提出tSB和tB是具有显著预测妊娠结局能力的指标。

综上所述，笔者利用着床前胚胎发育动力学指标与妊娠结局的关系，提出一个回归模型以通过胚胎发育动力学指标预测囊胚移植后是否有更高的妊娠可能：P=1/（1+y），y=-3.803+0.007×t5-0.004×t8-0.042×s3+0.023×tM+0.005×tSB+0.043×tB，并检验其有效性。从心理上增加医患双方信心，减少焦虑情绪。然而，本模型的回顾设计和模型本身所固有的偏差将使其临床应用有待进一步开发和挖掘。