Slug和Vimentin在甲状腺乳头状癌中表达及其与患者临床病理特征的关系研究

薛 栋 李梦宇 丁宝忠 宋相孔 夏修良

1.山东省滨州市人民医院普外一科，山东滨州 256610；2.山东省滨州市人民医院普外三科，山东滨州 256610；3.山东省滨州市人民医院神经内科，山东滨州 256610

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的内分泌肿瘤，约85%以上[1]的甲状腺癌属于此类型。近年来，PTC 发病率呈上升趋势，甚至部分微小乳头状癌患者在就诊时就发生了淋巴结转移[2]。上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是肿瘤发生、发展中的标志事件[3]。锌指转录因子Slug在EMT 中发挥主要作用，而EMT 又促进侵袭转移[4]。内分泌癌和口咽鳞癌组织中Slug蛋白高表达，并且与肿瘤患者的不良预后有关[5-6]。波形蛋白（Vimentin）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）是EMT 标志蛋白[7]，间叶细胞能表达Vimentin 与间叶表型转变有关。众所周知，具有高侵袭性的细胞高表达Vimentin，当成纤维细胞中的Vimentin 基因被敲除后细胞迁移力明显下降[8]。结肠癌中Vimentin 高表达，与TNM分期、淋巴结转移有关，是一个不良预后因素[9]。但PTC 中关于Slug 和Vimentin蛋白的联合研究报道较少。本研究重点探讨Slug 和Vimentin 与PTC 临床病理参数的相关性，旨在为探索PTC 侵袭转移的分子机制打下基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011年1月～2020年1月滨州市人民医院的103例PTC患者的癌组织标本作为研究组，其中男31例，女72例；年龄15～73岁，平均（42.5±6.8）岁；肿瘤位于单侧78例，位于双侧25例；伴有淋巴结转移48例，无淋巴结转移55例。根据美国癌症联合委员会（第八版）[10]TNM分期标准，其中Ⅰ期43例，Ⅱ期34例，Ⅲ期19例，Ⅳ期7例。分别将性别（男vs.女）、年龄（＜55岁vs.≥55岁），肿瘤直径（≤10 mm vs.＞10 mm）、肿瘤部位（单侧vs.双侧）、多灶性（无vs.有）、TNM（Ⅰ+Ⅱ期vs.Ⅲ+Ⅳ期）、淋巴结转移（无vs.有）、腺外侵犯（无vs.有）进行分组研究。选取同期的42例PTC患者的癌旁甲状腺组织作为参照组。纳入标准：①符合PTC 病理诊断标准；②术前未行放化疗或免疫治疗；③术中留取肿瘤组织或者癌旁组织；④患者或家属知情并签署知情同意书。排除标准：①转移性甲状腺癌；②长期使用免疫抑制剂等药物。所有标本预先行HE染色重新确诊，统计PTC 临床分期及淋巴结转移的情况。本研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 试剂

鼠抗人Slug 单抗和鼠抗人Vimentin 单抗采购于Santa Cruz 公司，工作浓度为1∶200；Envision 试剂盒由Dako 公司提供；阴性对照选用磷酸钠盐缓冲液（PBS）。

1.3 免疫组化步骤

选取含肿瘤组织的蜡块，由病理科医师重新进行病理诊断证实，石蜡块连续4 μm 切片、脱蜡、梯度乙醇处理。采取枸橼酸缓冲液（pH 6.0）热抗原修复，分别加入Slug 及Vimentin 一抗，添加二抗、DAB 染色（注意染色时间）、苏木素复染、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。镜下观察染色效果，PBS 作为阴性对照。

1.4 结果的判定

参考文献[11]的分级方法，两种蛋白阳性染色在显微镜下均表现为黄色、棕黄色甚至褐色。病理科专家于200倍视野下随机选取5个视野（每个视野＞200个细胞），按阳性细胞所占百分比及染色的强度进行判定，分别为0分（无染色）、1分（淡黄）、2分（棕黄）、3分（棕褐）。阳性细胞比例算分：≤10%为1分，＞10%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度与染色阳性细胞比例评分相乘，≥3 判为阳性表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计数资料采用率表示，比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC 中Slug 和Vimentin阳性表达

Slug蛋白主要表达于细胞核（图1，封三），Vimentin蛋白主要表达于细胞质（图2，封三）。Slug 与Vimentin分别在细胞核和细胞质呈棕黄或者棕褐色表达，癌旁组织中无表达或局部灶状表达。PTC组织中Slug 的阳性率为76.7%，而癌旁组织中Slug 的阳性率为26.2%，差异有统计学意义（P＜0.05）。PTC组织中Vimentin的阳性率为72.8%，癌旁组织中Vimentin 的阳性率为21.4%，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

图1 Slug阳性染色

图1 Slug阳性染色

图2 Vimentin阳性染色

2.2 Slug 和Vimentin 与PTC患者病理参数之间的关系

不同TNM分期、腺体是否外侵与是否伴有颈部淋巴结转移的PTC 中的Slug 和Vimentin阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。分期较晚、伴有腺体外侵犯、有颈部淋巴结转移的PTC 中的Slug 和Vimentin蛋白阳性率较高。不同年龄、不同性别、肿瘤不同部位和是否多灶性组的患者的Slug 和Vimentin阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

2.3 Slug 和Vimentin表达相关性

本研究入组的PTC组织中的Slug 和Vimentin蛋白均表现为阳性者49例，表现均为阴性者13例，Slug蛋白表达和Vimentin蛋白表达呈正相关（r=0.523，P=0.031）。

3 讨论

甲状腺癌在全世界内均呈明显上升的态势，目前居中国女性恶性肿瘤第四位。PTC 病例近年来呈现出越来越年轻化的趋势，且易发生引流区域的颈淋巴结转移，约有70%[12]的PTC患者在确诊时就发生了淋巴结转移，给广大人民群众造成巨大的社会和经济负担，因此关于PTC 侵袭转移的分子机制亟待解决。

EMT是特殊的病理现象，指上皮转变成间叶表型的病理过程，上皮来源恶性肿瘤形成中都要经历这个过程[13]。Slug 能抑制E-cadherin 的表达和促进EMT发生，且与分化程度、区域淋巴结转移、肿瘤恶性侵袭密切有关，是患者临床预后不佳的重要因子[6，14]。有研究报道，结直肠癌（CRC）中35.17%（51/145）的患者表达Slug，癌旁组织中7.59% （11/145）表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；且高表达Slug 的CRC患者生存期明显少于低表达Slug 患者[15]。最新的研究显示，食管癌和癌旁组织中Slug 基因的阳性表达率分别为68.53%、31.46%，且Slug蛋白阳性表达率与组织分化、肿瘤浸润的深度、区域淋巴结转移及临床分期比较，差异有统计学意义（P＜0.05）[16]。本研究显示，Slug在PTC 和癌旁组织的表达率分别为76.7%，26.2%（P＜0.05），提示Slug 促进了PTC 的发生、发展。本研究还显示，Slug 的阳性表达率与不同的年龄、性别、肿瘤的直径、肿瘤所在部位和多灶性差异无统计学意义，而与肿瘤的TNM分期、腺体外侵和颈部淋巴结转移差异有统计学意义（P＜0.05），提示Slug 在PTC 侵袭转移中起重要作用。

表1 Slug 及Vimentin 在不同甲状腺组织中的表达（例）

表2 Slug 及Vimentin表达与PTC 临床病理参数的关系[n（%）]

恶性肿瘤在侵袭转移中普遍存在EMT。一旦上皮细胞间的连接发生异常变化，E-cadherin表达下降，Vimentin 增加，细胞架构发生改变，继而肿瘤发生侵袭转移[7]。PTC 细胞在侵袭转移中存在EMT 现象[17]。有报道显示，Vimentin 在鼻咽癌中的阳性率为24.6%，提示Vimentin 与患者预后有关[18]。眼睑皮脂腺癌中的Vimentin表达与区域淋巴结转移、病理学分级和预后有关[19]。本研究结果显示，PTC 中的Vimentin高表达，Vimentin表达与临床病理特征如性别、年龄、肿瘤的直径、肿瘤所在部位、多灶性差异无统计学意义，而与腺体外侵、临床TNM分期及颈淋巴结转移表达差异有统计学意义（P＜0.05）；Slug 和Vimentin 呈正相关。Slug 和Vimentin 在PTC 中存在高表达的现象提示两者参与了PTC 恶性侵袭转移。

综上所述，PTC 中的Slug 和Vimentin 高表达，且其均与患者TNM分期、腺体外侵和淋巴结转移密切有关。推断Slug 可能促进了Vimentin表达，引起肿瘤细胞间黏附能力明显下降，最后导致甲状腺乳头状癌细胞侵袭转移，这为甲状腺乳头状癌的靶向诊疗提供了新依据。