微小RNA-218-5p 对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

孙鑫波，陈从波，陈绪华，黄力

十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院）1泌尿外科，2皮肤科，湖北 十堰 442000

膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤，传统的治疗手段如手术、化疗等虽有一定疗效，但复发率和转移率仍较高，近年来靶向治疗成为一个新的治疗方向。微小RNA（microRNA，miRNA）是内源非编码小RNA，在转录后水平调控基因表达，研究发现部分异常表达的miRNA与膀胱癌的发生发展密切相关。有报道显示，miRNA-218-5p通过负调控高迁移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）抑制结直肠癌细胞的增殖；下调miRNA-218-5p可通过调节HMGB1促进人脐静脉内皮细胞凋亡。有研究发现，miRNA-218-5p在膀胱癌组织中低表达，但其对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制尚不清楚。98序列相似的家族成员A（family with sequence similarity 98，member A，FAM98A）基因定位于人类染色体的2p22.3，研究发现其与多种肿瘤的发生发展过程相关，如FAM98A在子宫内膜癌中过表达，与其预后不良有关，FAM98A缺乏可显著抑制子宫内膜癌细胞活力，促进细胞凋亡。下调FAM98A可促进乳腺癌细胞增殖能力而抑制细胞迁移、侵袭和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称AKT）信号转导通路是细胞内重要的信号转导通路之一，可调节肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等，在肿瘤进展中起重要作用。有研究报道，抑制PI3K/AKT信号通路可提高紫杉醇对膀胱癌T24细胞的杀伤作用，提高化疗效果。姜黄素通过增加同源性磷酸酶张力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表达，抑制PI3K/AKT信号通路的激活而诱导人膀胱癌EJ细胞凋亡。本实验旨在研究miRNA-218-5p是否通过FAM98A及PI3K/AKT信号通路影响膀胱癌细胞的增殖和凋亡，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常膀胱组织细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞BIU-78、T24、EJ均购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清、RPMI1640培养基、胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒均购自美国Sigma公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自日本TaKaRa公司；Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；MTT试剂盒、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。Thermo FC酶标仪购自美国Thermo公司；FACSCantoⅡ流式细胞仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人正常膀胱组织细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞BIU-78、T24、EJ分别用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5% CO饱和湿度条件下培养，每天换液1次，待细胞融合至80%左右时，加入胰蛋白酶进行消化传代，选取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染与分组 取对数生长期的BIU-78细胞用无血清培养基同步化12 h，随后进行转染，将miRNA-con、miRNA-218-5p、si-con、si-FAM98A、anti-miRNA-con和anti-miRNA-218-5p分别转染至细胞BIU-78中，分别记为miRNA-con组、miRNA-218-5p组、si-con组、si-FAM98A组、anti-miRNA-con组和anti-miRNA-218-5p组，未进行任何处理的BIU-78细胞作为空白对照组（NC）；将miRNA-218-5p分别与pcDNA-con和pcDNA-FAM98A共同转染至细胞BIU-78中，分别记为miRNA-218-5p+pcDNA-con组和miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A组，转染均按照Lipofectamine2000试剂盒进行操作。

1.2.3 定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测miRNA-218-5p和FAM98AmRNA表达水平 收集以上各组细胞，提取总RNA，反转录成cDNA，按照TaKaRa荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin为内参进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95℃3 min；95℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；72 ℃延伸5 min。相对表达量采用2法计算。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白表达 收集以上各组细胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，10 340 r/min离心15 min，收集蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDSPAGE电泳后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入一抗（1∶1000），4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2000）室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.2.5 MTT 法检测细胞增殖率 在以上各组细胞培养至48 h时加入20 μl的MTT溶液，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μl DMSO振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处光密度（optical density，OD）值。细胞增殖率（%）=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各组细胞后离心收集，PBS漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min。流式细胞仪检测波长488 nm和530 nm处的荧光强度。实验重复3次，取均值。

1.2.7 荧光素酶报告基因检测实验检测miRNA-218-5p对FAM98A 的靶向调控 TargetScan数据库预测显示

FAM98A

3'UTR区域有miRNA-218-5p结合位点。构建含有miRNA-218-5p结合位点的

FAM98A

-3'UTR野生型及突变型报告基因载体，在BIU-78细胞中转染miRNA-218-5p和野生型、突变型报告基因载体。依据说明书要求，使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定。实验结果以荧光素酶活性和Renilla活性的比值进行统计学分析。实验重复3次，取均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 膀胱癌细胞和人正常膀胱组织细胞系中miRNA-218-5p和FAM98A 表达情况的比较

与人正常膀胱组织细胞SV-HUC-1相比，膀胱癌细胞BIU-78、T24、EJ中miRNA-218-5p表达水平均降低，

FAM98A

mRNA和蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）（图1、表1）。因miRNA-218-5p和FAM98A表达在BIU-78细胞中与正常细胞差异最明显，故后续实验均采用BIU-78细胞。

表1 膀胱癌细胞和人正常膀胱组织细胞系中miRNA-218-5p、FAM98A表达情况的比较（±s）

图1 Western blot 检测膀胱癌细胞和人正常膀胱组织细胞系中FAM98A 蛋白的表达情况

2.2 过表达miRNA-218-5p对BIU-78膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

与miRNA-con组相比，miRNA-218-5p组BIU-78膀胱癌细胞中cyclin D1、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）表达水平均降低，miRNA-218-5p、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）表达水平均升高，细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（图2、图3、表2）

表2 NC组、miRNA-con组、miRNA-218-5p组BIU-78膀胱癌细胞中各蛋白及细胞增殖、凋亡情况的比较（±s）

图2 流式细胞仪检测NC组、miRNA-con组、miRNA-218-5p组BIU-78膀胱癌细胞凋亡情况

图3 Western blot检测NC组、miRNA-con组、miRNA-218-5p组BIU-78膀胱癌细胞cyclin D1、BAX和Bcl-2蛋白表达情况

2.3 敲减FAM98A对BIU-78膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

与si-con组相比，si-FAM98A组BIU-78膀胱癌细胞中BAX表达水平升高，FAM98A、cyclinD1、Bcl-2表达水平均降低，细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（图4、表3）

表3 NC组、si-con组、si-FAM98A组BIU-78膀胱癌细胞中各蛋白及细胞增殖、凋亡情况的比较（±s）

图4 Westernblot检测NC组、si-con组、si-FAM98A组BIU-78膀胱癌细胞cyclin D1、BAX和Bcl-2蛋白表达情况

2.4 miRNA-218-5p靶向FAM98A

通过TargetScan数据库预测到FAM98A与miRNA-218-5p存在结合位点。荧光素酶报告基因检测实验结果显示，miRNA-218-5p分别与

FAM98A

野生型及突变型报告基因载体共转染后，野生型BIU-78细胞的荧光素酶活性明显降低（

P

＜0.01）；而突变型BIU-78细胞的荧光素酶活性变化不显著（

P

＞0.05）（表4）。Western blot检测结果显示，相较于miRNA-con组，miRNA-218-5p组BIU-78细胞中FAM98A表达水平降低（

P

＜0.05）；相较于antimiRNA-con组，anti-miRNA-218-5p组BIU-78细胞中FAM98A表达水平升高（

P

＜0.05）（图5、表5）。

表4 miRNA-con或miRNA-218-5p与报告质粒共转染BIU-78细胞后荧光素酶活性的比较（±s）

表5 miRNA-con组、miRNA-218-5p组、anti-miRNA-con组、anti-miRNA-218-5p组BIU-78膀胱癌细胞中FAM98A蛋白表达情况的比较（±s）

图5 Western blot检测miRNA-con组、miRNA-218-5p组、anti-miRNA-con组、anti-miRNA-218-5p组BIU-78膀胱癌细胞中FAM98A 蛋白表达情况

2.5 过表达FAM98A对BIU-78膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

与miRNA-con组相比，miRNA-218-5p组BIU-78膀胱癌细胞中BAX表达水平升高，FAM98A、cyclin D1、Bcl-2表达水平均降低，细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）；与miRNA-218-5p+pcDNA-con组相比，miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A组BIU-78膀胱癌细胞中BAX表达水平降低，FAM98A、cyclin D1、Bcl-2表达水平均升高，细胞增殖率升高，细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（图6、表6）

表6 miRNA-con组、miRNA-218-5p组、miRNA-218-5p+pcDNA-con组、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A组BIU-78膀胱癌细胞中各蛋白及细胞增殖、凋亡情况的比较（±s）

图6 Western blot检测miRNA-con组、miRNA-218-5p组、miRNA-218-5p+pcDNA-con组、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A组BIU-78膀胱癌细胞中FAM98A、cyclin D1、BAX和Bcl-2蛋白表达情况

2.6 PI3K/AKT信号通路蛋白表达情况的比较

与miRNA-con组相比，miRNA-218-5p组BIU-78膀胱癌细胞中p-PI3Kp85、p-AKT表达水平均降低（

P

＜0.05）；与miRNA-218-5p+pcDNA-con组相比，miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A组BIU-78膀胱癌细胞中p-PI3Kp85、p-AKT表达水平均升高（

P

＜0.05）。（图7、表7）

表7 miRNA-con组、miRNA-218-5p组、miRNA-218-5p+pcDNA-con组、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A组BIU-78膀胱癌细胞中p-PI3Kp85和p-AKT表达情况的比较（±s）

图7 Western blot检测miRNA-con组、miRNA-218-5p组、miRNA-218-5p+pcDNA-con组、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A组BIU-78膀胱癌细胞中p-PI3Kp85和p-AKT 蛋白表达情况

3 讨论

膀胱癌的发病率和病死率呈逐年增长趋势，严重威胁着人们的健康。研究发现miRNA可充当抑癌基因或促癌基因参与膀胱癌细胞的增殖、迁移、凋亡和药物敏感性等。在非小细胞肺癌中miRNA-218-5p低表达，通过表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。miRNA-218-5p还通过PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路靶向EGFR抑制翼状胬肉上皮细胞的增殖和迁移。此外，拮抗miRNA-218-5p可减弱WNT信号转导并减少三阴性乳腺癌的转移性骨病。本实验结果显示，miRNA-218-5p在膀胱癌细胞中低表达，过表达miRNA-218-5p可抑制BIU-78膀胱癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，同时促进BAX表达，抑制cyclin D1、Bcl-2表达。

有报道显示，FAM98A是肿瘤细胞迁移、侵袭和集落形成所需的蛋白精氨酸甲基转移酶1（protein arginine methyltransferase 1，PRMT1）的新型底物。敲除

FAM98A

可抑制结直肠癌的进展。在非小细胞肺癌中FAM98A高表达，FAM98A通过p38-ATF2信号转导途径促进非小细胞肺癌细胞的增殖。本实验结果显示，FAM98A在膀胱癌细胞中高表达，敲减

FAM98A

可抑制膀胱癌细胞BIU-78增殖，诱导细胞凋亡，同时促进BAX表达，抑制cyclin D1、Bcl-2表达。此外，miRNA-218-5p靶向负调控FAM98A的表达，过表达FAM98A能逆转miRNA-218-5p对膀胱癌细胞BIU-78的增殖抑制和凋亡促进作用。PI3K/AKT信号通路是参与细胞增殖调控的重要通路之一，既有抗凋亡作用又有促凋亡作用，以抗细胞凋亡为主。钙黏蛋白13（cadherin 13，CDH13）下调表达通过激活PI3K/AKT通路促进膀胱癌细胞增殖和克隆形成。抑制miRNA-130b-3p通过上调PTEN表达，抑制PI3K-AKT及整合素β1/黏附斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）信号通路的激活，诱导凋亡，抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本实验中，过表达miRNA-218-5p抑制PI3K/AKT信号通路中p-PI3Kp85和p-AKT蛋白的表达，而过表达

FAM98A

能逆转miRNA-218-5p对p-PI3Kp85和p-AKT表达的抑制作用，说明miRNA-218-5p可能通过调控

FAM98A

进而影响PI3K/AKT信号通路。

综上所述，miRNA-218-5p可抑制膀胱癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与FAM98A及PI3K/AKT信号通路有关，将可为膀胱癌的预防和治疗提供新靶点。