两种检测技术在血液筛查中对乙肝病毒筛查的应用

德央 曲吉

西藏自治区血液中心 西藏拉萨 850000

血液安全是目前全世界广泛关注的焦点，为了保证输血的安全可靠，世界卫生组织（WHO）建议对每一位献血者进行健康征询及血源性传染病的筛查[1]。随着科学的进步发展，Busch 等科研人员通过研究证实核酸检测能将HBV、HCV 和HIV 血清学检测的窗口期缩短[2]。本中心也于2019 年开展核酸检测工作，本文以初步了解拉萨地区无偿献血者的乙肝病毒感染情况，对比了NAT 与ELISA 检测技术在乙肝病毒筛查中的临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 样本来源

本中心于2019年1月～2020年9月采集的5999 例无偿献血者标本，初筛合格，且符合《献血者健康检查要求》（GB18467-2011）。每位无偿献血者共收集3 管标本，第1 管为分离胶促凝真空采血管用于EIA 检测及谷丙转氨酶检测；第2 管为EDTA-K2 抗凝真空采血管用于核酸检测；第3 管同为EDTA-K2 抗凝真空采血管，是核酸检测备用管（需要复检时使用）。核酸管采集后保证4h 内离心（3500rpm/min），三管均保存于2～8℃，24h 内检测（备用管于-20℃冻存，只可复溶一次）。

1.2 方法

1.2.1 ELISA 筛查试剂与仪器

每个检测项目均采用两种不同的试剂盒来进行检测。HbsAg 由上海科华及厦门英科新创，实验操作过程均严格按照实际说明书进行。仪器:E-STARLET 全自动加样仪和酶免分析仪。

1.2.2 NAT 检测试剂与仪器

筛选出ELISA 检测合格的标本进行核酸试验单检流程，严格按照达安基因核酸试剂说明书做好试剂准备、加样及PCR 扩增准备工作。仪器为DA3500 全自动核酸提取仪和安誉AFD9600 扩增仪。

1.2.3 复检及确认

对鉴定检测均为反应性的献血者需定期采取血样进行ELISA、核酸检测，观察该献血者ELISA 检测是否转阳，以给献血者作出最终解释。

1.3 检测结果判定

1.3.1 ELISA 结果判定

＜Cutoff 值判为阴性，≥Cutoff 值判为阳性。两种试剂均反应性则为阳性不合格，否则为阴性；若只有其中一种试剂为阳性则该样本两种试剂皆复检两孔，均为阴性则合格，均为阳性或其一为阳性则判不合格。

1.3.2 NAT 结果判定

1.3.2.1 质控品结果判定（暨批实验有效性）

阴性质控品除内标Ct ≤40 外，其他均无值，否则重测；阳性质控品检测项均为Ct ≤40，否则重测；室内质控品检测项均为Ct ≤45，否则重测。

1.3.2.2 待测标本结果判定（暨单测试有效性）

在本批次试验质控有效，并且内标（IC）有效的条件下，本批次试验结果有效且可参考。阳性判断标准为有明显S 型扩增曲线且标本检测结果Ct 值≤45，则结果判为有反应性。阴性判断标准为无明显S 型扩增曲线，标本检测结果的Ct 值为“无值”，且相应的内对照结果Ct 值≤40。若本次结果出现反应性，则取该样本的备用管双孔复检，若再次呈反应性，则判定该项目为阳性，若无反应性则判为阴性。

1.3.2.3 内标检测的有效性判定

标本测定结果如果为核酸阴性，则内标结果必须为阳性，否则标本的测定结果无效重新测定。标本测定结果如果为核酸阳性，内标结果可以不做考虑。

2 结果

2.1 HBV 检出率

在5999 份血液标本中，采用ELISA 和NAT 两种方法检测后，共检出HBV 阳性标本65 份，HBV检出率为1.08%（65/5999）。

2.2 两种检查的特异性、灵敏度

2.2.1 ELISA 的特异性、灵敏度结果

5999 份 血 液 标 本 中，ELISA 检 出33 份 标 本HBV 阳性，检出率0.55%。追踪1 月后，再次检测出30 份阳性。因此，ELISA 在BHV 病毒检测中的灵敏度为52.38%、特异性为50.77%。

2.2.2 NAT 的特异性、灵敏度结果

NAT 检测方法，对5999 份血液标本中检出65份BHV 阳性，检出率1.08%。追踪1 月后，再次检测出63 份阳性。对于NAT 在检测BHV 中的灵敏度100%、特异性为96.92%。

2.3 两种检测特异性、灵敏度的对比 见表

3 讨论

本中心地处西藏自治区首府拉萨，拉萨地区流动人口数量庞大，居民的乙肝疫苗接种意识不强，而且针对传染病的防范意识薄弱。2011～2015 年的调查数据显示，拉萨地区献血人群HBsAg 检出率是1.06%，高于当时的银川、南京等地区[3,4]。本次检测结果显示，2019～2020 年拉萨地区献血人群HBsAg 检出率为1.08%，和往年水平相当。提示西藏自治区血液安全问题依然存在，不容忽视，采血人员需要重点关注；此外需继续加强对乙肝等传染病的健康教育，提高乙肝疫苗的接种率。

本组结果显示，ELISA 检测方法的灵敏度为52.38%，特异性50.77%，均处于较低水平。文献研究显示，以抗原抗体为检测对象的酶联免疫检测方法，“窗口期”较长，尤其是抗体，由于抗体的产生需要从病毒进入体内刺激机体发生免疫反应，再到抗体足以被检出，这个过程需要更长的时间，因此导致酶联免疫检测最重要的漏检因素为“窗口期”漏检[5,6]，此外，也可能会存在隐匿性的HBV 感染（OBI），此感染者由于自身免疫或病毒的变异等因素导致抗原结构改变，导致血清学检测呈阴性，本组就有30 人份血样就是“窗口期”，漏检率较高，因此在临床工作中对于一次检测HBV 阴性者，一定要有半个月以上的追踪、复查。不可掉以轻心，这关系到受血者的健康问题。但因为ELISA 检测在检验室中应用交广，且时间长。基层实验室均配有，操作简单，费用不高，社会效益高。NAT 检测可检出存在于血清中HBV-DNA[7]，能在早期检测出HBV感染，可以忽略“窗口期”直接发现病毒。本组中NAT 的灵敏度为100%，特异性为96.92%，处于较高水平，故，作者建议有条件的医疗机构在血液筛查中尽可能的采用NAT 检测，当然在安全血液的筛选试验中，NAT 也能够很好的与ELISA 检测起到互补作用。通过两种检测方法比较，结果显示核酸检测能更进一步的保证临床供血的安全可靠性，在发现“窗口期”及隐匿性病毒感染的检测中，发挥着重大的作用。