基于高通量测序技术探究2型糖尿病合并慢性牙周炎患者牙周治疗前后龈下菌群的变化①

牛家慧，李 创，李 蓉，胡永权，张江畔，张亚宏

（石家庄市第二医院口腔科，河北石家庄050051）

2型糖尿病是患者机体胰岛素作用缺陷或分泌功能障碍所引发的表现为血糖异常升高的代谢性疾病。慢性牙周炎多由革兰阴性细菌感染所导致的发生在牙周支持组织中的一种的慢性疾病。已有研究证实了糖尿病与慢性牙周炎具有相互促进、相互影响的关系，二者之间可能具备相同的炎性作用机制[1-3]：一方面，糖尿病是慢性牙周炎迁延不愈的主要危险因素；另一方面，慢性牙周炎不仅是糖尿病患者失牙的重要诱因，还有可能促使糖尿病患者血糖调控的失衡，使患者全身病情进一步恶化[4]。慢性牙周炎的始动因子主要是患者牙菌斑微生物与宿主免疫机制与炎性反应间的相互作用[5]。如果能够进一步明确患者的致病菌群，将有助于抑制牙周炎患者的慢性炎症水平，从而有利于患者血糖的控制和全身病变的改善。但于细菌培养技术和口腔菌群的多样性的限制，目前为止相关研究也仍有不少问题尚未完全明晰。而随着以16S核糖体DNA（Ribosomal DNA，rDNA）为基础的高通量测序技术这一新工具的广泛应用，有望通过对微生物群落分析，得出能够纵向覆盖的测序数据，再对样本微生物物种进行聚类和比对，从而估计出目标微生物群落的详细物种构成，克服传统培养方法的缺点[6]。本研究对2型糖尿病合并慢性牙周炎的患者进行采样，利用16SrDNA高通量测序技术对比分析了治疗前与治疗后3个月龈下菌群结构及相对丰度的变化，旨在进一步阐明其发病机制，并为制定更加科学的防治措施提供依据。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年6月—2020年6月于石家庄市第二医院口腔科就诊的100例2型糖尿病合并慢性牙周炎患者。其中男性46例，女性54例，年龄31～53岁，平均年龄（43.24±7.81）岁。纳入标准：（1）参照世界卫生组织1999年提出的诊断标准明确诊断为2型糖尿病；（2）患者糖尿病病情稳定1年以上，未出现严重并发症；（3）研究期间患者糖尿病用药、饮食、运动习惯未有明显变化；（4）明确诊断中重度慢性牙周炎；（5）至少有18颗恒牙完全萌出；（6）至少有4个探诊深度＞5 mm和出血指数＞2的牙周袋，并分别分布在4个象限；（7）患者及其家属知情同意。排除标准：（1）合并其他严重的心、肝、肾等其他重要脏器疾患；（2）3个月内服用过抗生素；（3）6个月内接受过任何牙周治疗；（4）嗜酒、吸烟或口腔卫生习惯不好。本研究通过医院伦理委员会批准（伦理号：L201902）。

1.2 治疗 首先对患者进行龈上洁治，至肉眼观察不到菌斑、牙石，并无色素沉着，从而避免对实验产生干扰。1周后正式开始龈下刮治和根面平整（subgingival scaling and root planing，SRP）治疗，患者接受局部麻醉，先用超声手柄进行龈下刮治，再用刮治器行对根面进行手工平整。牙周袋冲洗使用3%过氧化氢，消毒使用1%碘甘油涂布。至根面光滑平整，无残余龈下牙石为治疗有效。

1.3 标本采集 采样时间为SRP治疗前和治疗3个月之后，取样位置为患者口腔的同一位点。先通过清水漱口洁净口腔，再使用无菌棉卷隔湿，从口腔各象限中选择1个探诊深度＞5 mm和出血指数＞2的牙周袋（病理性龈沟）作为采样位点，用无菌镊子夹持40号无菌根管用吸潮滤纸，将其纸尖轻轻插入牙周袋底部，40 s后取出置于1.5 mL微型离心（epoxy epoxide，EP）管中，保存于－20℃冰箱待检测。

1.4 实验检测

1.4.1提取 样本宏基因组DNA(Greater DNA，gDNA)用基因组提取试剂盒(CW2091S，江苏康为公司)提取。DNA的完整性和纯度使用琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计检测，DNA浓度用Qubit dsDNA HS试剂盒(Q32854，Invitrogen公司)检测，得到的gDNA保存于－20℃。

1.4.2建库及测序 起始建库首先取10 ng gDNA，使用自动聚焦声波基因组剪切仪Covaris M220进行片段化，纯化时选择1.8×DNA纯化磁珠(N411，Vazyme)，文库构建选择通用DNA文库构建试剂盒(ND607，Vazyme)。使用荧光定量PCR仪(CFX96，BioRad)和Qsep100全自动核酸分析系统进行文库的浓度测定和片段分布测定。测序策略是Paired-end150；测序平台为IlluminaNo-vaSeq6000。

1.4.3 数据处理 下机数据使用FastQC进行质量评估，接着使用Trimmomatic选择过滤标准，去除低质量碱基和接头等。基于参考数据库对数据进行快速比对归类[7]，以相似性将其分为不同小组（OTU）。相似水平为97%，通过利用贝叶斯算法将不同OTU的序列分析，统计样品在门、科、属、种等不同水平的构成。使用Usearch软件平台与Silva数据库进行对比。最后分别统计样本中各物种在不同分类上的序列数，并样品总体序列数相比，得到相对丰度。采用群落显著性差异分析metastats平台(http://metastats.cbcb.umd.edu/)进行统计学分析。

2 结果

2.1 龈下菌群多样性分析 一共200个样本，总共测得29 640 637条原始序列。经过筛选优化之后，得到高质量序列28 521 945条，序列读长平均为452 bp；每个样本平均164 336条序列；OTU 31 546个，每个样本157个。

2.2 治疗前后门水平的菌群结构 共检测到17个门，各样本所检测的菌门在9～16，其中有8个菌门为各样本共有，在每组中均占比＞99%。包括互养菌门、变形菌门、螺旋体门、梭杆菌门、厚壁菌门、Candidate-division-TM7、放线菌门、拟杆菌门，但治疗前后序列数及相对丰度比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 龈下菌群中的主要门类及对应序列数和相对丰度

2.3 治疗前后属水平的菌群结构 共检测到131个菌，其中相对丰度均＞1%的有15个。其中，有6个已确定菌属（产线菌属、密螺旋体属、月形单胞菌属、普雷沃菌属、梭杆菌属和卟啉单胞菌属，相对丰度占比＞50%。与治疗前相比，链球菌属和纤毛菌属较治疗前相对丰度明显上升（P＜0.05），而坦纳菌属则明显降低（P＜0.05）。见表2。

2.4 治疗前后种水平的菌群结构 共检测到菌种284个，其中治疗前217个，治疗后238个。检测到的有6种可疑致病菌，见表3。

表2 龈下菌群中的主要属类及相对丰度

表3 检测到的可疑致病菌治疗前后序列数及相对丰度差异

3 讨论

龈下微生物是牙周炎发生发展的直接诱因，而通过物理手段对齿周菌斑进行清除，是治疗多数牙周炎患的金标准[8]，但合并2型糖尿病的慢性牙周炎患者存在病情反复的可能，因此有必要进一步探明潜在致病菌种，从而为完善临床治疗策略提供新思路。

本研究选择了100例合并2型糖尿病的慢性牙周炎患者作为研究对象，采集治疗前后的菌群样本进行测序分析，获得高质量序列数共28 521 945条，再通过OTU代表序列进行分类，最终一共检测284种细菌，包含在17个门的131个属中，证实了合并2型糖尿病的慢性牙周炎患者牙周组织中龈下菌群的丰富性和多样性。17个门中，在牙周组织龈下菌群中占主体地位的一共有8个门，并且其中厚壁菌门的革兰阳性菌增多，拟杆菌门的革兰阴性菌的所占比例减少，但差异无统计学意义，与Sebastian等[9]的报道相一致，其研究主要采用了个体化Ion Torrent基因组测序，检测出占99.8%的序列数的7个菌门，但其研究纳入病例少，且未有统计学分析。

本研究从治疗前与治疗后的样本中一共检测出131个不同菌属，主要有产线菌属、月形单胞菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、梭杆菌属和密螺旋体属一共6个主要属细菌，在总含量中占比大于50%以上。提示龈下菌群虽然总体种类丰富，但是只有极少部分菌属具有明显的数量优势。弯曲菌属、链球菌属等需氧菌属只占总体含量的2%以下，证明了在患者牙周组织龈下菌群中是以高度厌氧的杆菌为主要优势菌。

本研究显示，接受治疗的患者龈下菌群结构发生了明显的变化，其中纤毛菌属、链球菌属的相对丰度在治疗后3个月与治疗前相比有明显上升，其中的主要原因是牙菌斑被有效清除后，牙周组织的微生态得以改善，从而促使了有益菌的保留。治疗前后坦纳菌属比较，发现其相对丰度明显降低，证实了干预性治疗能够有效地清除牙周炎的致病菌。随着有益菌的重新定植以及菌群结构的逐渐平衡，使得牙周组织的慢性炎症得以缓解，牙周袋深度也随之变小，抑制厌氧菌的生存，同时为需氧或微需氧细菌的繁殖提供了条件[10]。

当牙周组织处于疾病状态时，其微环境中细菌群落可能会较健康状态时多样性明显下降[11-12]。本研究在种水平上发现了284种细菌，与文献[13]中单纯慢性牙周炎患者的口腔龈下菌群数量一致。本研究还发现了接受牙周病治疗后患者龈下菌群的种类增多，表现出了结构多样性上升的趋势，证实了治疗的有效性，可能有利于正常菌群结构的恢复。

本研究一共检出了中间链球菌、福赛坦纳菌、中间普雷沃菌、牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、变黑普雷沃菌等6种重要致病菌，丰富了我国在糖尿病患者牙周炎致病菌种类方面的资料。其中，中间普雷沃菌与福赛坦纳菌是慢性牙周炎患者龈下菌斑中的数量优势菌，常在重度牙周炎患者中生长繁殖于附着丧失处的龈下菌斑中，与牙槽骨吸收及牙周袋深度增加有着密切联系[14]。本研究通过对比发现中间普雷沃菌及福赛坦纳菌的相对丰度在治疗后明显降低，提示了2型糖尿病合并慢性牙周炎患者的治疗中控制菌斑及定期维护的重要性。

综上所述，治疗后糖尿病合并慢性牙周炎患者牙周组织的有益菌的相对丰度升高，而多数可疑致病菌的相对丰度明显降低，明确了干预性治疗对龈下微环境和菌群结构平衡具有重要意义。与传统细菌培养相比，高通量测序技术能够更加客观地体现牙周炎的治疗效果，同时能准确和全面地反映龈下菌群结构，有助于深入细致地掌握牙周组织微生态的相互关系，从而有利于制定更加科学有效的抗菌策略，为个体化诊治及预后评估提供可能性。但本研究仅设计了自身前后对照，存在一定局限性，未来将纳入更多普通牙周炎患者作为对照组进行分析，以进一步提高结论的说服性。