黄芩苷抑菌作用及对大鼠实验性牙周炎抗炎成骨能力的研究①

龚 怡，王 琛，吴泽钰,2，森巴特·毛吾艾，吴仲蓬，赵 今,2

（1新疆医科大学第一附属医院/附属口腔医院牙体牙髓科，2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，乌鲁木齐830054）

慢性牙周炎是全球第六大流行疾病，它影响着世界上近50%的人口，是成年人牙齿脱落的主要原因[1]。研究证实紊乱的微生物群落会导致牙周炎的发生，平衡的微生物群落能够维持健康的牙周状况[2]。牙周治疗以机械治疗为主，抗生素仍是牙周炎机械清创的辅助药物，在使用的过程中会出现一些不可避免的副作用。中草药作为一种替代医学疗法，在牙周治疗中的药理活性好和副作用较少而受到越来越多的关注[3]。研究发现天然药物可抑制牙周病致病菌的生长，调节龈下菌斑的生态平衡，在治疗牙周病方面卓有成效[4]。近年来人们不断探索和研究黄芩苷对牙周炎的作用，期望从中药提取物的方向探索治疗牙周炎的新方法。本研究采用实验性大鼠牙周炎模型探究黄芩苷对牙周致病菌的抑制作用，并从抗炎、抑制破骨细胞能力方面观察对实验性牙周炎疗效，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器和试药 ST16低温高速离心机（赛默飞世尔公司），Multiskan GO全波长酶标仪（赛默飞世尔公司），P30020001解剖显微镜（德国蔡司），Williams牙周探针（上海康桥齿科医械厂）；黄芩苷（上海源叶生物有限公司，21967-41-9），BHI脑心浸出液肉汤（美国BD公司，7075659），TRAP染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，G1492），COX-2大鼠ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，CSB-E08008r），MMP-9鼠ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，CSB-E13399r）。

1.2 实验动物 6～8周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠42只，由新疆医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(新)2018-0002，分笼饲养，自由进食、水，饲料为动物实验中心提供的标准大鼠饲养饲料。

1.3菌株 牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingiva⁃lis,P.g）W83、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum,F.n）ATCC 25586和伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.a）ATCC 700685，以上菌株均购买于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.4 方法

1.4.1 菌株培养及药物的配置 将P.g、F.n、A.a复苏后接种于BHI血琼脂平板，37℃厌氧（80%N2，20%CO2）培养48 h后，菌落鉴定后挑取菌落于BHI液体培养基中，继续培养48 h，取处于生长对数期的细菌用于实验，调整菌液浓度备用（P.g为107CFU/mL，F.n为107CFU/mL，A.a为108CFU/mL）。32 g/L黄芩苷母液配置：将黄芩苷溶于生理盐水中，用2%碳酸氢钠调整pH至7～8。经0.22µm的无菌滤器过滤除菌，置4℃备用。0.01%、0.1%及1%黄芩苷甘油的配置：取黄芩苷粉末10 mg，加入甘油1 mL，混匀，超声震荡10 min，即得1%的黄芩苷甘油，用同样得方法制得0.01%，0.1%黄芩苷甘油。置4℃备用。2%盐酸米诺环素甘油的配置：称取盐酸米诺环素粉末20 mg，加入甘油10 mL，混匀，超声震荡10 min，即得2%盐酸米诺环素，置于4℃备用。

1.4.2 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）测定 黄芩苷溶液按二倍稀释法分别溶于BHI液体培养基中，使黄芩苷溶液最终浓度达到32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 g/L。将P.g、F.n菌悬液与各组溶液按照体积比为1∶1（V∶V）比例，接种于96孔板中，将A.a与各组溶液按照体积比为1∶9（V∶V）比例置于1.5 mL EP管中，均于80%N2，20%CO2，37℃条件厌氧培养48 h。酶标仪测定OD600nm值，实验与溶剂组OD值差值≤0.05的最低浓度为MIC。选择大于MIC浓度的各孔，涂布于BHI琼脂血平板上，置于相同条件培养48 h，观察菌落数少于5个对应的药物最低浓度为MBC。实验独立重复3次取平均值，每组3个平行。

1.4.3 大鼠实验性牙周炎造模及分组 采用随机数字表法将大鼠随机分7组，每组6只。2%盐酸米诺环素组(IM组)，0.1%黄芩苷组(BM组），1%黄芩苷组(BH组)，0.001%黄芩苷组(BL组），甘油溶剂组(Tri组)：造模第一天各组即给予20µL相应的药物局部涂抹左侧上颌第一磨牙结扎处，并在龈沟内上药，禁食水1 h。1次/d，间隔24 h，共14 d。牙周炎模型组(EP组)：造模后，仅每日测量大鼠体质量、PD、龈沟出血指数（SBI），不进行任何干预，共14 d。正常组(NG组)：不进行任何干预，每日测量体质量。用4-0的缝合线结扎左上第一磨牙，将结扎日期定为第0天。从第0天开始每日测量大鼠体质量，从第一天开始每日测量大鼠探诊深度PD和SBI。

1.5 统计学处理 采用SPSS22.0统计学软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，经过正态分布检验，符合正态分布，对各组数据进行方差齐性检验，若方差齐选用单因素方差的LSD-t检验；若方差不齐，则行秩和检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1黄芩苷对3种牙周致病细菌MIC和MBC的测定结果 黄芩苷对P.g、F.n、A.a的MIC分别为1.0、2.0、2.0 g/L，MBC分别为2.0、8.0、4.0 g/L，见表1。

2.2各组大鼠一般情况和临床指标 实验结束时，各组大鼠体质量、PD及SBI见表2。每组大鼠的体质量均较实验前有所增加，EP、Tri、BL、BM、BH组前后体质量的增幅均较NG组和IM组低，见图1。PD在进行造模的前1周，数值逐渐增加；1周后Tri、EP组均继续上升，其余用药物干预的各组数值均呈现上下波动并逐渐稳定，见图2。SBI同样在造模前1周，各组数值逐渐增加。造模进行1周后，各组的SBI均小范围的上下浮动并且趋于稳定，见图3。

表1黄芩苷对3种主要牙周炎致病菌MIC及MBC的实验结果

表2 实验结束时各组大鼠一般情况和临床指标结果

图1各组大鼠体质量变化

图2各组大鼠PD变化

图3 各组大鼠SBI变化

2.3 各组大鼠牙周组织病理学检查 HE染色结果观察到NG中牙龈上皮及钉突均完整，沟内上皮无破坏，胶原纤维排列整齐，无明显炎症浸润，见图4g。Tri、EP组可见牙龈与牙齿之间结扎痕迹明显，有深牙周袋形成，并且牙龈上皮和沟内上皮出现明显的破坏，组织的完整性较差，龈沟内可见到一些肉芽组织团块，牙齿周围的胶原纤维排列出现紊乱，见图4e，4f。IM组可见明显结扎痕迹，但是牙周袋及上皮的完整程度较EP好，炎症浸润减少。龈沟内未见炎性团块，但有异常角化的上皮，龈沟底可见异常生长的钉突深入结缔组织，胶原纤维结构仍有紊乱，见图4a。BL、BM组中结扎痕迹明显，BL组中龈沟内炎性肉芽组织增生比BM组多，且BM组的上皮钉突比BL明显，炎症浸润减少，结扎处下方的胶原纤维与BL组都出现紊乱，见图4b，图4c。BH组中龈沟内未见到明显的肉芽组织，炎症浸润减少，胶原纤维结构趋于整齐，见图4d。

图4各组大鼠HE染色结果（×100）

2.4各组大鼠牙周组织TRAP染色表达结果 TRAP染色选取位于第一磨牙牙槽嵴顶的位置进行对破骨细胞的数量的观察。TRAP阳性表达时呈现紫红色。NG中牙槽嵴顶上方可见一处颜色较淡的阳性颗粒，骨陷窝内未见明显的阳性颗粒表达，见图5g。Tri及EP中的牙槽嵴顶上方可见大量的破骨细胞，骨陷窝边缘也出现阳性颗粒，见图5e，图5f。IM牙槽嵴顶的上方可见破骨细胞，其阳性颗粒在牙槽嵴顶及牙槽嵴边缘均比EP少，见图5a。BL、BM、BH中破骨细胞含量均比EP少，并且随着药物浓度的增加，TRAP阳性表达依次减少，呈现药物浓度依赖性，见图5b、5c、5d。

2.5各组大鼠血清中COX-2，MMP9表达的结果用药各组的血清中COX-2含量，与EP组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），EP组与NG组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3，图6；药物组中，IM组与BH组差异无统计学意义（P＞0.05）。用药各组的血清中MMP-9含量与EP组差异均有统计学意义（P＜0.05），EP组与NG组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），而IM组、BM组、BH组两两之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3，图7。

表3血清COX-2、MMP-9含量的ELISA结果

图5各组大鼠TRAP染色结果（×200）

图6各组大鼠血清中COX-2含量

图7各组大鼠血清中MMP-9含量

3 讨论

临床上牙周治疗主要是强调以机械策略[5]为主并辅以药物的结合，清除牙菌斑和牙结石，再利用全身或者局部用药到达机械治疗不能到达的病变部位，抑制牙菌斑微生物激活宿主免疫机制[6]，缓解炎症反应，促进愈合[7]。黄芩苷是黄芩的主要成分之一，具有清热解毒、抑菌抗炎、抗肿瘤等药理作用[8]。研究表明黄芩苷缓释膜可对重度牙周炎患者的龈沟液培养物具有抑菌作用，其作用与剂量呈浓度依赖关系[9]。本研究也证实了，黄芩苷在浓度为1、2、2 g/L时，对P.g、F.n、A.a有抑制作用。有研究人员[10]将黄芩苷和洗必泰以9∶1(w/w)的比例包裹成纳米颗粒，发现能对口腔中一些代表性细菌的生物膜起到抑制作用，达到广谱的抗菌作用。张璇[11]将黄芩苷配置成混悬液，对实验性牙周炎大鼠用全身给药的方式发现可以增加牙周组织及血清中骨形态发生蛋白-2（Bone Morphogenetic protein-2，BMP-2）的含量，有利于牙周组织再生。也有研究人员在建立大鼠实验性牙周炎模型后，用黄芩苷给动物经口灌胃干预，结果证实黄芩苷可减少牙周炎动物的牙槽骨丢失和结缔组织破坏[12]。尽管研究表明，在治疗牙周炎方面，黄芩苷确实发挥了很好的疗效，但是其生物利用度低，水溶性差的缺点限制了其作为口服药物的疗效[13]。所以本次实验以局部给药的方式，将黄芩苷粉末与甘油进行混合，制作成了凝胶状的药剂对大鼠实验性牙周炎干预。本实验的研究人员发现，牙槽嵴顶处破骨细胞的数量也随着黄芩苷的浓度梯度增加而减少，初步可以推测黄芩苷可以抑制破骨细胞的形成。

牙周炎患者的外周血中炎症因子的水平升高，与系统性疾病的进展，均存在相关联系[14]。因此对于牙周炎与全身疾病的治疗二者是相辅相成的，了解促炎介质的调节及其牙周组织中的作用一直是许多研究的目标。基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinases-9，MMP-9)主要由中性粒细胞和巨噬细胞分泌，调节组织和疾病的炎症[15]。上调后的环氧合酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是炎症和病理前列腺素E2(prostaglanding E2，PGE2)的来源，与骨吸收、肿瘤血管生成和结缔组织破裂有关[16]。本研究用ELISA的方法评估了牙周炎大鼠血清中COX-2和MMP-9的含量，相比正常组，在EP组中，血清中的COX-2和MMP-9均有所升高，随着药物浓度的增加，血清中的COX-2和MMP-9均出现下降。COX-2和MMP-9出现升高的原因一方面可能是由于结扎处通过感染或是破溃的牙周袋上皮，刺激牙周组织，局部产生了高浓度的炎症因子进入血循环；另一方面也可能是由于炎症的播散，引起血液中的白细胞或是其他组织释放了更多COX-2和MMP-9。这表明了牙周炎不仅会破坏局部牙周组织，对全身情况也有一定的影响。但是，现有的研究结果并不能充分证明牙周炎与一些系统性疾病是因果关系，而只能说明这两种炎症因子是全身疾病的一种危险因素。

黄芩苷不仅对牙周致病菌有抑制作用，还在抑制牙槽骨吸收和抵抗全身炎症反应方面发挥了疗效，为黄芩苷在防治牙周炎方面的开发提供了理论依据。