青果对牙周炎致病菌生长的影响及防治牙周炎的网络药理学研究①

王 琛，吴泽钰，龚 怡，赵 今，2

（1新疆医科大学第一附属医院附属口腔医院牙体牙髓科，2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，乌鲁木齐830054）

牙周病是不分地域、民族和年龄的世界范围内的高患病率疾病，而慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是最为常见的一类，约占牙周炎者的95%[1]。近年来，青皮、蜂胶等中草药对口腔致病菌的抑制作用已被实验证实[2-3]。青果（Fructus Canarli）为橄榄科植物橄榄的干燥成熟果实，含多种化合物，有清热利咽、生津解毒等多种药理作用。有资料表明青果中含有鞣花酸、没食子酸、柚皮苷、齐墩果酸等活性成分[4]，具有抗病毒[5]、抗氧化[6]等生物作用。网络药理学是基于系统生物学的理论，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科，许多研究也使用网络药理学探讨疾病的分子机制[7]。本文探讨青果提取物对牙周致病菌生长的影响，并利用网络药理学方法探讨其防治慢性牙周炎的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 体外抑菌试验

1.1.1药材提取 青果（购自新疆参茸中维药饮片有限公司）粉碎后过60目筛，称50 g加水250 mL，100℃恒温水浴30 min，静置冷却，低温冷冻干燥后4℃备用[8]。

1.1.2菌株及培养基 牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis，W83)，伴 放 线 聚 集 杆 菌(A.actinomycetemcomitans，ATCC700685)，具核梭杆菌 (F.nucleatum，ATCC25586)，以上菌株均购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)。脑-心浸液培养基（BHI）：称3.7 g BHI培养基，加100 mL蒸馏水溶解，121℃，20 min高压灭菌，调整pH值。

1.1.3 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最低杀菌浓度（minimum bactericidalconcentration，MBC）的测定 青果提取物按二倍稀释法溶于BHI液体培养基中，最终浓度64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 g/L分光光度计调整菌悬液密度至1×108cfu/mL(OD600＝1)，将菌悬液与药液按照1∶1（V∶V）比例，各100µL接种于96孔板中。震荡l min后，置于厌氧条件（80%N2，20%CO2），37℃培养24 h。ΔOD≤0.05的最低浓度为MIC。选择＞MIC浓度的各孔，取20µL涂布于BHI血琼脂培养基上，37℃培养24 h，菌落数少于5～6个的最低浓度为MBC。重复3次。

1.2 青果的化学成分及对应作用靶点的筛选 在中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)以及中药综合数据库(TCMID)中检索“青果”，得到青果的化学成分、吸收、分布、代谢和排泄（ADME）及其作用靶点。利用PubChem和ChemBL确定所得成分的三维结构，建立青果的化学成分数据库。

1.3 活性成分筛选 根据所获得化合物的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、化合物类药性(druglikeness，DL)、该化学成分在青果中的占比，及牙周炎防治潜力为筛选条件。

1.4 CP的靶点筛选 通过在Gene Cards、DisGeNET、DrugBank和OMIM中输入chronic periodontitis搜索基因，得到的疾病靶点与青果治疗靶点，筛选出共同靶点。

1.5 成分-靶点网络构建与分析 将青果化学成分、治疗靶点导入Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，Network Analyzer分析拓扑属性，计算节点的中介中心度(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和拓扑系数(topological coefficient，TC)的相关信息，确定关键节点。

1.6 PPI网络构建 利用STRING 11.0数据库，输入靶点，得到分值＞0.4的高置信度蛋白互作数据，构建PPI网络，利用Network Analyzer分析拓扑属性。

1.7 基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 生物学信息注释数据库(DAVID)为大规模基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息。使用DAVID 6.8对靶点进行GO、KEGG富集分析，筛选生物途径和分子功能筛选错误率(false discovery rate，FDR)＜0.001，P＜0.001，利用R 3.6.1软件将结果可视化。

1.8 代谢通路-CP靶点-青果活性成分网络的构建将代谢通路信息、核心靶点和青果活性成分导入Cytoscape3.7.2中，利用“Merge”功能将其融合，构建“代谢通路-交集靶点-青果活性成分”网络图。

2 结果

2.1青果提取物对3种牙周致病菌MIC、MBC结果实验结果表明，青果提取物对3种牙周致病菌均存在抑制作用，青果提取物浓度分别为4.0、2.0、2.0 g/L的P.g、A.a、F.n菌液明显澄清，用酶标仪测得ΔOD＜0.05。结果详见表1。

2.2 青果化学成分的筛选TCMSP、TCMID数据库获得青果化学成分56个，筛选后得到7个，详见表2。

2.3 青果作用于CP的潜在靶点 青果的7个化学成分得到作用靶点319个。CP在4个数据库中得到去重后疾病靶点2 132个，药物作用靶点与疾病靶点进行韦恩分析，得到154个青果治疗CP的潜在靶点，详见图1和表3。

表1青果对主要牙周致病菌的MIC及MBC

图1 Venn图

表2 青果主要化学成分及参数

表3 青果治疗CP的成分作用靶标信息

2.4 药物-成分-靶点-疾病网络 运用Cytoscape3.7.2构建青果-成分-靶点-CP网络（见图2），共161个节点(7个成分，154个靶点)和840条边。网络拓扑学分析显示，成分的平均度数为37.714，说明青果治疗CP有多靶点属性，其拓扑学参数见表4，可以看出青果中发挥主要作用的成分为槲皮素、柚皮素、柚皮苷等。青果各成分作用于多种靶点，表明其防治CP发挥药效过程中不同成分之间存在协同作用。

图2青果-成分-靶点-CP网络

表4 青果化学成分的拓扑学参数分析

2.5 PPI网络 PPI网络有154个节点和3 018个边缘，网络的平均度值为38.7（图3A），按照度值降序排序筛选出核心靶蛋白10个：白介素6(Interleukin 6，IL6)、白蛋白(Albumin，ALB)、丝氨酸/苏氨酸激酶1(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、肿 瘤 坏 死 因 子(Tumor necrosis factor，TNF)、肿瘤蛋白P53(Tumor Protein P53，TP53)、丝裂原活化蛋白激酶3(Mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)、胱天蛋白酶3(Caspase 3，CASP3)、表皮细胞生长因子(Pro-epidermal growth factor，EGF)、前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2，PTGS2)，见表5、图3B。

表5青果治疗CP核心靶点及拓扑学参数

2.6 GO和KEGG富集分析 对上述156个蛋白进行GO富集分析，根据FDR＜0.1确定了815个GO条目，见表6、图4。由表6可见，生物过程(BP)相关条目637个，涉及RNA聚合酶II启动子转录的正调控、对药物的反应等；分子功能(MF)相关条目113个，涉及蛋白质结合、酶结合等；细胞成分(CC)相关条目65个，涉及细胞外间隙、胞外区等。KEGG分析得到81条信号通路，见表7、图5，信号通路包括TNF信号通路、癌症通路、PI3K-Akt信号通路等；疾病通路有乙型肝炎、胰腺癌、美洲锥虫病等；生物过程相关通路有成骨分化、细胞凋亡、细胞自噬等。

图3青果化学成分治疗CP靶PPI网络

表6青果治疗CP的潜在靶点GO富集分析结果（各前5条）

2.7 青果活性成分-核心CP靶点-代谢通路网络由用Cytoscape3.2.1的“Merge”功能构建的“代谢通路网络图-核心CP靶点-青果活性成分”网络图，由图6可见36个信号通路、156个核心靶点、7个药物成分间关系密切。这可能说明青皮中的多种化合物可以通过调节多条信号通路，调节慢性牙周炎的炎症反应。

图4青果治疗CP的潜在靶点的GO富集分析

图5青果治疗CP的潜在靶点的KEGG富集分析

表7青果治疗CP的潜在靶点KEGG富集分析（前10条）

图6青果活性成分-核心抗癌靶点-代谢通路网络

3 讨论

青果提取物对P.g，A.a，F.n的MIC分别为4.0、2.0、2.0 g/L，MBC分别为8.0、4.0、4.0 g/L。文献[4-5]证实了青果对流感病毒A、艾滋病毒HIV-1有很好的抑制作用，并有抗肿瘤的作用[8]。牙周病是以牙菌斑生物膜为主要致病因素的疾病，本研究通过实验证明青果对3种牙周病主要致病菌有较好抑制作用，说明青果有潜在防治牙周病的能力。

为了系统、深层面地研究中药的作用机制，将现有的单靶点、单药模式研究模式更新为网络靶点、多组分模式，建立了一种新的中药网络药理学方法。本研究利用此方法构建了“青果-成分-靶标-慢性牙周炎”的调控网络，系统地分析青果的化学成分多通路、多靶点防治慢性牙周炎的潜在机制。获得7个活性化学成分，154个靶点。调控网络显示槲皮素、柚皮苷、柚皮素、β-谷固醇等匹配多个靶点，是青果防治慢性牙周炎的主要成分。在PPI网络中，IL-6、ALB、AKT1、VEGFA、TNF等蛋白靶点与青皮活性成分及慢性牙周炎相关性更高，尤其IL-6和TNF与其相关性更加显著，它们可能是青果调控慢性牙周炎网络的主要调控因子。将154个靶点进行GO富集分析，青果的化学成分主要涉及生物过程有RNA聚合酶II启动子转录的正调控、药物的反应等方面;涉及分子功能有蛋白质结合、酶结合等方面;涉及的细胞成分有细胞外间隙、胞外区等方面。KEGG富集分析到81条信号通路，包括TNF信号通路、癌症通路、PI3K-Akt信号通路等。

在小鼠肠道脓肿中，青果的主要成分柚皮苷通过RhoA/ROCK通路衰减MLC磷酸化和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化，可抑制IL-6和TNF的释放[9]；在小鼠心肌炎症中，柚皮苷通过激活PI3K-AKT信号通路抑制NF-κB核转运，同时也可以显著下调IL-6和TNF水平[10]；在动脉粥样硬化小鼠中，柚皮苷也可显著抑制TNF诱导的NF-κB的核转运[11]。还有研究证实，青果的主要成分槲皮素可通过调控PI3K-AKT信号通路[12]、NF-κB信号通路抑制炎症因子的表达[13]。以上文献报道结果与本实验结果相似，说明柚皮苷、槲皮素等活性成分可通过调控PI3KAKT、TNF相关信号通路调控牙周炎症的发生发展。

IL-6在慢性牙周炎中介导炎症反应的产生，促进IL-1、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等细胞因子在炎症局部的大量释放，加剧牙周组织的损伤。TNF在牙周炎的炎症反应的启动、牙槽骨吸收和结缔组织附着丧失中发挥核心作用[14]。并且TNF细胞因子超家族激活细胞存活、死亡和分化的信号通路，并可激活多种信号转导途径，如NF-κB信号通路，从而促进更多炎症因子和细胞因子的分泌。本研究通过PPI网络筛选出的核心蛋白靶点中，IL-6、AKT1、VEGFA、MAPK3、EGF均存在于本研究富集到的PI3K-Akt信号通路，可激活其介导的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号传导途径，一旦mTOR活化可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[15]，从而影响慢性牙周炎的疾病进程。

本研究探讨了青果提取物对3种牙周致病菌的生长抑制作用，同时应用网络药理学的方法，对青果可能的防止牙周炎的活性化学成分、作用靶点、机制做了探索性研究，由于数据库更新不够及时，未分析化学成分间及信号通路间的协同作用，其结果可能不够全面。此外，网络药理学预测中药治疗CP的作用机制及相关靶点，仍需进一步基础实验验证。但初步证明了青果对3种牙周致病菌有抑制作用，揭示了青皮防治慢性牙周炎的药理活性和作用机制，为青果各成分进一步的临床研究提供理论基础，同时为实现更经济有效的药物开发提供实验依据。