一种新的党参根腐病害镰孢菌鉴定＊

漆永红，李敏权，曹素芳，龚成文，米永伟，武伟国，李雪萍，陈爱昌，孙新荣，李继平

(1.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃兰州 730070；2.甘肃省农业科学院林果花卉研究所，甘肃兰州 730070；3.甘肃省农业科学院经济作物与啤酒原料研究所，甘肃 兰州 730070；4.定西市植保植检站，甘肃 定西 743000；5.渭源县农业技术推广中心，甘肃 定西 748200）

党参（Codonopsis pilosula）为桔梗科党参属，多年生草本植物，分布在我国北方山地林边和灌丛中，海拔高度为1560～3100m。党参作为传统的补益药，具有补中益气和健脾益肺的功效[1-2]。根据党参的外形和产地，可以分为西党、潞党、东党和条党等[3]。甘肃省定西市渭源县是我国的“党参之乡”，主要生产白条党参。随着甘肃省党参人工栽培面积逐年扩大，生长环境改变和土壤病原菌数量不断积累，党参根腐病害已成为制约其产量和品质的重要因素之一，对当地党参产业发展受到严重的影响。

关于党参根腐病害国内一些学者有研究，王艳等[4]报道了甘肃省渭源县和陇西县党参根腐病病原菌为尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporiums）。刘春叶等[5]发现，洛党参根腐病在田间4 月中下旬发生，8月份达到高峰。余中莲等[6]报道，尖孢镰孢菌（F.oxysporiums）引起川党参根腐病。近年来，一种新的党参根腐病在我省党参种植区普遍发生，当地农户误称为“黄心病”，由于发病初期，叶片从绿色逐渐变为灰绿色和黄色，内部维管束由白色变为黄色、黄褐色、褐色至深褐色而得名。据前期调查发现，一般田间发病率为15%～30%，严重的达50%以上，甚至绝收；病原菌在土壤或带菌参根上越冬，上年已感染参根在5 月中下旬发病，6～7 月为发病高峰期；当年的参根发病较晚，6 月中下旬出现发病症状，8月达到高峰期。该病害在我省党参种植区的为害面积逐年增加，尤其以重茬党参发病严重，给种植户带来巨大的经济损失。关于该病害在我省临洮县、渭源县、漳县、宕昌县、岷县等地的病原种类未见报道，本试验拟对我省发生的一种新的党参根腐病的发病症状进行研究，以确定其病原、致病性及其优势病原种类，为该病害的田间防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病样采集与病原菌分离和纯化

2018 年6 月在甘肃省临洮县、渭源县、漳县、宕昌县、岷县等主要党参生产基地采集发病植株，记录好采样信息，装入自封袋。采用常规组织分离法[7-8]，剪取发病维管束5mm×5mm 组织块在75%酒精中浸泡5s，然后转移至1.5%次氯酸钠溶液中消毒1min，无菌水漂洗3 次晾干，置于PDA 培养基平板内，在25℃培养箱培养5～7d。从菌落边缘切取菌丝块置于香石竹叶片琼脂（CLA）培养基（琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，每皿加入长度1cm 的无菌康乃馨叶片3 片），在25℃培养7～10d。将分离纯化的菌株转接至PDA 斜面，4℃保存备用。

1.2 致病性测定

采用柯赫氏法则进行致病性测定，将分离纯化的病原物PDA 培养基打成10mm 菌饼接种在党参（渭党1 号）芽尖部，无菌土掩埋接种部位，每个病原菌接种15 株党参幼苗，以没有带菌的PDA 培养基接种党参芽尖部作为对照，45 d 后调查发病情况，病害分级标准为，0 级：根部无病斑；1 级：根部病斑面积占总根部面积的1/4 以下；3 级：根部病斑面积占总根部面积的1/4～1/2；5 级：根部病斑面积占总根部面积的1/2～3/4；7 级：根部病斑面积占总根部面积的3/4 以上。同时将发病部位再次分离培养，用形态学和分子生物学鉴定，确定分离得到的病原菌与初接病原菌是否为同一病原菌。

1.3 病原菌形态学鉴定

将病原菌分别接种在PDA 和CLA 培养基（促进产孢）上，25℃下培养7d 和10d 后，观察并拍照记录菌落形态、颜色、产孢结构与分生孢子形态、大小，根据Burgess[9]分类方法和标准进行病原菌种类鉴定。

1.4 病原菌分子生物学鉴定

1.4.1 真菌基因组DNA 提取

刮取PDA 培养基上的病原菌菌丝，采用真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒E.Z.N.ATM.HP Fungal DNA Kit（OMEGA）的方法提取DNA[10]，保存于-20℃备用。

1.4.2 分子鉴定的引物

本试验用镰孢菌特异性引物[11-12]，核糖体内部转录间隔区ITS1 和ITS4 序列分别为TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和TCCTCCGCTTATTGATATGC；镰孢菌特异性引物TEF1αF 和TEF1αR 的序列分别为 ATGGGTAAGGARGACAAGAC 和 GGARGTAC CAGTSATCATGTT。

1.4.3 PCR 扩增、凝胶电泳、测序及序列分析

PCR 扩增体系（25μL）：10×Buffer2.5μL、2.5mol·L-1dNTP4μL、10μmol·L-1正反向引物各1μL、Taq 酶0.5μL、DNA 模板1μL，用ddH2O 补足至25μL。PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，25 个循环；72℃延伸10 min，4℃保存备用。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得的序列与GenBank 核酸序列库进行同源性比对分析，并用Mega 6.0Neighbor-joining 法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 发病症状

地上部叶片由绿色变成黄色和灰绿色（图1A），出现急性萎蔫，早晚稍有恢复，天气晴朗时很快全株萎蔫枯死。病原菌从党参芽尖部侵入，发病初期，根外表正常，纵剖根部，内部维管束组织自上而下逐渐变为黄色、黄褐色、褐色至深褐色（图1B）；健康植株的内部维管束组织呈白色（图1C）。

图1 党参根腐病

2.2 病原菌在田间的分布及种类鉴定

共采集到党参标样23 份，室内分离到镰孢菌株216 株。4 种镰孢菌在每个县区均有分布，对分离到的菌株进行鉴定和统计，尖孢镰孢菌112 株，占51.85%；茄病镰孢菌49 株，占22.69%；三线镰孢菌和锐顶镰孢菌为34 株和21 株，分别占15.74%和9.72%，其中尖孢镰孢菌为党参根腐病的优势种群。各病原菌的培养性状和形态学特征鉴定如下：

菌株编号WDX-4-2-2 尖孢镰孢菌（F.oxysporum）：在PDA 培养基上菌落白色，大型分生孢子镰孢形，中间粗，两端尖细，具3～5 个横隔膜，多为3 个隔，大小为23.0～33.0μm×2.0～4.0μm，足胞明显；小型分生孢子椭圆形，单胞，无色，大小为3.0～14.5 μm×1.5～3.0μm。

菌株编号DS-3-1-2 茄病镰孢菌（F.sonali）：在PDA 培养基上菌落白色，较致密；大型分生孢子无色，较宽，两端圆，马特型，2～5 个隔膜，多为3 个隔膜，大小为20.0～38.5μm×3.5～5.5μm；小型分生孢子，椭圆形、肾形，无色，大小为6.5～15.0μm×2.5～4.5μm。

菌株编号DS-4-1 三线镰孢菌（F.tricinctum）：在PDA 培养基上菌丝羊毛状，繁茂，白色或粉红色；大型分生孢子新月形，两端渐尖，顶细胞弯曲并逐渐变细，足细胞明显，3～5 分隔，28～50μm×2.5～5.5 μm；小型分生孢子椭圆形或柠檬形，0～1 隔，5.5～17.5μm×3.5～8.5μm。

菌株编号DS-3-1-1 锐顶镰孢菌（F.acuminatum）：在PDA 培养基上菌丝白色，茂盛；大型分生孢子镰刀形，通常4～6 分隔，32.5～82.5μm×2.0～5.5 μm；小型分生孢子纺锤形或肾形，0～1 分隔，多为0分隔。

2.3 病原菌分子生物学鉴定结果

测序结果与GenBenk 数据库中Nucleotide Blast 进行比对，尖孢镰孢菌（F.oxysporum）、茄病镰孢菌（F.sonali）、三线镰孢菌（F.tricinctum）和锐顶镰孢菌（F.acuminatum）的序列分别为597、544、483 和537bp。用Mega7.0 软件，采用邻接法构建系统发育树，党参根腐病与F.oxysporum、F.sonali、F.tricinctum和F.acuminatum 亲缘关系最近（如图2 所示）。结合形态学和分子生物学特征，把甘肃省临洮县、渭源县、漳县、宕昌县、岷县的党参根腐病鉴定为尖孢镰孢菌（F.oxysporum）、茄病镰孢菌（F.sonali）、三线镰孢菌（F.tricinctum）和锐顶镰孢菌（F.acuminatum）。

图2 病原菌系统发育树

2.4 4 种镰孢菌对党参的致病性测定结果

室内致病性测试结果表明，接菌植株表现出与自然病株相同的症状，未接菌植株表现正常，从接种发病党参植株上全部分离到病原菌，形态学和分子生物学鉴定为尖孢镰孢菌、茄病镰孢菌、三线镰孢菌和锐顶镰孢菌。与对照相比，尖孢镰孢菌、茄病镰孢菌、三线镰孢菌和锐顶镰孢菌均对党参有致病性，但发病率和病情指数不同（见表1）。尖孢镰孢菌的致病性最强，发病率和病情指数最高，分别为100.0%和46.4，显著高于茄病镰孢菌、三线镰孢菌和锐顶镰孢菌，而茄病镰孢菌、三线镰孢菌和锐顶镰孢菌对党参的致病力较弱，三者差异不显著。

表1 4 种镰孢菌对党参的致病性测定

3 讨论

随着党参栽培面积的不断扩大和连年种植，病虫草害等有害生物的为害日益严重，给党参生产造成的损失越来越大。本试验针对当地农户误称为党参“黄心病”开展研究，结果发现是一种新的党参根腐病，首次确定了该病害的发病症状和病原菌的侵染方式，病原菌从芽尖侵入，内部维管束自上而下变褐色，地上部叶片出现急性萎蔫，导致全株枯死。该病害在我省党参种植区普遍发生，带来巨大的经济损失，严重影响了党参产量提高和品质提升。

根腐病属土传病害，防治比较困难[13]，由于病原物在土壤中可以存活多年。鉴定党参根腐病害的病原菌是防治的前提条件和基础，明确病原种类对采取有效和科学的防治技术起到关键作用。本试验初步明确了党参根腐病的病原为尖孢镰孢菌（F.oxysporum）、茄病镰孢菌（F.sonali）、三线镰孢菌（F.tricinctum）和锐顶镰孢菌（F.acuminatum），其中尖孢镰孢菌为优势种，这表明党参根腐病害的病原种类复杂，存在多种镰孢菌复合侵染的现象，进一步说明了田间党参根腐病害为害的普遍性和严重性。同时，调查发现该病害主要为害根部和茎基部，发病症状隐蔽，早期识别和诊断难度大，一旦发病出现急性萎蔫，导致全株枯死，来不及进行防控，这也说明了提前采取有效的防治措施控制该病害的重要性。国内外的一些学者对其他植物病害通过环介导等温扩增（LAMP）的方法进行快速检测[14-17]，建立了快速、准确检测病原菌的方法，对病害及时有效控制起到重要的指导作用，关于党参根腐病害病原菌的快速检测和病害诊断有待于进一步研究。

镰孢菌是农业生产中为害最严重的土传病原物之一，是一种常见的土传病原菌，具有很强的寄生和腐生能力，同时会产生毒素[18-19]。镰孢菌的致病性主要通过产生镰孢菌酸毒素降低寄主植物的抵抗力，影响寄主植物的细胞代谢；产生细胞壁降解酶降解寄主植物的细胞壁防御组织和保护组织，致使寄主植物细胞内的营养物质释放；产生一些蛋白物质影响病原菌在寄主植物根部定植和萌发，对寄主植物防卫物质解毒，使寄主植物失去防御能力[20]。本试验仅明确了党参根腐病害的发病症状、不同镰孢菌的种类和优势病原菌尖孢镰孢菌，但关于不同镰孢菌和党参根腐病的致病机理有待于进一步研究。

党参病害在高温多雨、低洼积水、藤蔓繁茂和湿度大的连作地块发病严重[21]。在党参移栽前，尽可能平整地块。本试验由多种镰孢菌引起的党参根腐病可采用综合方法来解决，其中农业防治最直接的措施就是施用充分腐熟的农家肥，遏制病原菌通过带菌种子和种苗进行远距离传播。因中药材的经济效益驱动，长期轮作和休耕在我省大多数种植区难以实施，短期轮作可以起到缓解病害的为害，生产中建议党参和其他禾本科作物轮作，避免连作和重茬。一些虫害造成的伤口和病原菌复合侵染加重病害的发生[22]。在实际生产中，及时防治地下害虫，培育和选择无病虫感染、无机械损伤和表皮光滑健康的种苗是减轻发病的有效措施。国内的一些学者通过化学药剂和生物菌剂防治中药材病害[23-27]。一些杀菌剂前期防效较好，但中后期防效较差，基于党参对农药残留要求的特殊性，在种植前通过生物农药进行土壤消毒和药剂浸苗是预防党参根腐病的重要措施之一。