金黄色葡萄球菌对临床常用抗菌药物的敏感性及毒力基因检测分析

刘雅静,刘勤勤

(陕西省西安市长庆油田职工医院 检验科,陕西 西安,710201)

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)致病力较强，可形成多种抗原蛋白、酶及毒素等，是导致患者出现感染性疾病的主要病原菌。耐甲氧西林金葡菌(MRSA)对于全部β内酰胺类抗生素均有耐药性，同时对氟喹诺酮类、氨基糖苷类及大环内酯类抗菌药物也都有耐药性[1-2]。mecA基因介导了甲氧西林的耐药性，其基因编码为青霉素联合蛋白(PBP)2a。只要金葡菌内可检测到编码PBP2a或mecA基因，即可认定是MRSA菌株。研究[3]显示,mecA基因阴性、苯唑西林耐药MRSA内检测出mecC基因可能是甲氧西林耐药所介导的另一机制。LI M等[4]2012年研究发现金葡菌内有细胞壁锚定蛋白受控sasX的编码基因，多存在于医院中的致病性金葡菌内。本研究分析了金葡菌对临床常用抗菌药物的敏感性及其毒力基因检测结果，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 菌株

采集2013年8月—2018年8月在本院分离的金葡菌129株行药敏试验，排除患者同一位置的重复菌株，金葡菌分离自胸腹水、脑脊液及血液等无菌体液标本中。将金葡菌ATCC 29213作为标准菌株。

1.2 抗菌药物和试剂

试剂与器皿: 聚合酶链反应(PCR)试剂(购自日本TaKaRa公司)、Mueller-Hinton琼脂和哥伦比亚血平皿(购自英国OXOID公司)。抗菌药物: 利奈唑胺(购自英国Sequoia Research Products公司)、磷霉素、万古霉素、甲氧苄啶、替考拉宁、去甲万古霉素、左氧氟沙星、青霉素、利福平、苯唑西林、庆大霉素、氨苄西林、阿米卡星、头孢唑林(购自中国食品药品检定研究院)。

1.3 研究方法

① 检测抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC): 依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)制订的M07-A9方案中的推荐方法进行检测，氨苄西林受试含量0.04～62.00 mg/L,甲氧苄啶受试含量是0.078～150.000 mg/L,磷霉素的受试含量是0.126～249.000 mg/L,其他药物受试含量为0.07～130.00 mg/L,接种菌量为104cfu/点，同时设立无抗菌药物的对照平皿。培养24 h后可观察到细菌的生长，对结果进行读取，受试药物对于质控菌株MIC数值位于质控范围内，对照平皿中受试菌良好生长。MIC定义为未看到细菌生长的最低药物含量。② 结果判定: 依据2014年CLSI准则[5]对药敏结果进行判定，苯唑西林MIC高于4.00 mg/L即判定为MRSA。③ 制备MRSA DNA模板，选取新鲜的MRSA菌落1～2个，放置在eppendorf管内，含TE(由Tris和EDTA配制而成)缓冲液200 μL; 摇匀后加入10 μL溶葡萄球菌素，水浴30 min,在干热器内加热后快速冷却，离心获取上清液是金葡菌的DNA模板。④ PCR扩增条件，预变性95 ℃下6 min,循环条件为95 ℃下35 s、49 ℃(mecA)/48 ℃(mecC)/51 ℃[杀白细胞毒素(PVL)]/49 ℃(sasX)下30 s,72 ℃下45 s,共进行4次循环，而后延伸,70 ℃下6 min,储存。

1.4 统计学分析

采用WHONET 5.6软件进行药敏数据分析。

2 结 果

2.1 苯唑西林耐药菌株

苯唑西林琼脂稀释结果显示,70株对苯唑西林耐药(苯唑西林的MIC>4.00 mg/L),判定为MRSA,占54.26%。其余59株为甲氧西林敏感金葡菌(MSSA),占45.74%。

2.2 PCR检测mecC与mecA基因

临床分离进行MRSA的DNA模板制备，对临床分离所得的45株MRSA分别采用mecA、mecC基因的PCR引物进行PCR扩增，检测发现耐药基因mecA阳性检出率为100.00%，耐药基因mecC则未检出，见图1。

图1 临床MRSA菌株的mecA基因扩增图

2.3 PCR检测MRSA内sasX基因与PVL

PCR检测MRSA内sasX基因与PVL基因发现,sasX基因阳性检出率为46.67%(21/45),sasX基因阴性检出率为53.33%(24/45),琼脂糖电泳结果提示45株MRSA内均未检出PVL基因，见图2。

图2 MRSA菌株内sasX基因扩增图

2.4 抗菌药物对MSSA、MRSA的MIC情况分析

MRSA对多种抗菌药物的耐药率高于MSSA,MRSA对于β内酰胺类药物耐药率高于MSSA,且对左氧氟沙星、阿米卡星及庆大霉素等非β内酰胺类药物也有耐药性，其耐药率为48.00%以上，但75.00%以上MRSA对甲氧苄啶与利福平比较敏感。MSSA对β内酰胺类药物比较敏感，除青霉素外，头孢唑林、氨苄西林及苯唑西林对MSSA的90%最低抑菌浓度(MIC90)、50%最低抑菌浓度(MIC50)都低于1.00 mg/L,且MSSA对非β内酰胺药物也非常敏感，其耐药率均低于11.00%。见表1、2。

2.5 抗菌药物对sasX阴性与sasX阳性的MRSA的MIC分析

sasX阴性与sasX阳性的MRSA对左氧氟沙星、磷霉素和β内酰胺类药物都比较耐药，但对甲氧苄啶、利福平、阿米卡星及庆大霉素的耐药率则不完全一致，见表3、4。

3 讨 论

金葡菌会导致肺炎、骨感染及皮肤软组织感染等感染性疾病，同时也是造成医疗机构内血流感染的主要病原菌，临床应用甲氧西林后即发生了首株MRSA[6]。随后几十年中，MRSA在全世界范围内开始流行，且临床患者产生的耐药问题也越来越严重，引起了广泛关注。CHINET细菌耐药性监测网2014年数据报道[7]显示，临床金葡菌检出率是9.6%,位居全年临床分离菌株的第5位，且位居革兰阳性菌的首位。

表1 抗菌药物对MRSA的MIC分析

表2 抗菌药物对MSSA的MIC分析

表3 抗菌药物对sasX阴性MRSA的MIC分析

表4 抗菌药物对sasX阳性MRSA的MIC分析

本研究分离的MRSA检测结果显示,MRSA对非β内酰胺类与β内酰胺类抗菌药物都比较耐药，但对于磷霉素与甲氧苄啶比较敏感。除青霉素外,MSSA对于其他β内酰胺类抗菌药物依然敏感，其MIC90均低于1.00 mg/L。本研究显示菌株均未对利奈唑胺、提卡拉宁及万古霉素耐药，和CHINET细菌耐药性检测数据[8]近似。金葡菌能够形成特殊PBP2a,为mecA基因编码，经过转座子所携带同时整合到葡萄球菌染色体mec位置[9-11]。因此，只要金葡菌内可检测出mecA基因，就是MRSA菌株，本研究显示MRSA中有45株携带mecA基因。

相关研究[12]显示,MRSA菌株中对于头孢西丁与苯唑西林都耐药者其PBP2a、mecA基因都是阴性。同时PCR检测显示,MRSA内检测出和mecA基因同源性为70%以上耐药基因，被称作mecALGA251基因。此团队将库存的金葡菌行mecALGA251基因筛选，结果显示在1975年所分离的1株金葡菌内也有相同基因型，说明金葡菌内存在mecALGA251基因已有40余年时间，且可能来自人类菌株。2012年，临床将mecALGA251基因重新命名为mecC基因。本研究显示，检测45株MRSA没有mecC基因。目前关于mecC基因为阳性MRSA也只在欧洲有相关报道，该基因可能有地域差异，另外也可能为PCR扩增条件或引物不够完善，还需对检测方法进一步改善。若微生物实验室内检测出MRSA对于头孢西丁或苯唑西林耐药，且PCR检测mecA基因是阴性，则可能存在mecC基因[13-14]。2012年临床首次检测到金葡菌内存在sasX基因，该基因多存在于医院环境金葡菌内，临床分离金葡菌可能会经过获取sasX基因对医院环境更加适应，导致医院内连续感染。本研究结果显示,45株MRSA内sasX基因阳性率为46.7%,同时对于非β内酰胺类抗菌药物的耐药率比sasX基因阴性MRSA高，和白耀霞等[15]研究结论一致。目前，临床MRSA问题仍比较严重，美国CDC报道[16]显示，异质性万古霉素中介金葡菌、万古霉素中介金葡菌与万古霉素耐药金葡菌在世界范围内均有报道，而万古霉素耐药菌株是革兰阳性菌内耐药广泛的菌株，临床上可有效治疗该菌株的药物还不太多。

综上所述，MRSA对临床大多数抗菌药物都有耐药性，临床需对MRSA加强监测。