红曲中非酿酒酵母的分离鉴定及其对黄酒风味成分的影响

程凯森 张美芳 黄玲玲 周化斌 杨海龙

(温州大学生命与环境科学学院，浙江 温州 325035)

黄酒是以大米为原料添加发酵剂酿造而成的传统发酵食品，富含氨基酸、低聚糖、多糖等功能成分，营养丰富、风味独特、历史悠久，为世界三大酿造酒之一[1]。红曲黄酒是以红曲或乌衣红曲为发酵剂酿造的一种特色黄酒，以色红、味醇、香浓而著称[2-4]。传统黄酒酿造过程是在开放的发酵系统中完成，参与酿造的微生物来自酒曲、酿造用水、发酵容器及空气等，其中酒曲中的微生物最丰富，研究人员运用MiSeq高通量测序、PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-gradient gel electrophoresis)以及分子生物学结合生物信息学分析等技术分析了福州红曲、古田红曲、乌衣红曲中的微生物菌群结构，确定优势微生物包括紫红曲霉(Monascuspurpureus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黄曲霉(A.flavus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、芽孢杆菌(Bacillussp.)、魏斯氏菌(Weasellasp.)、片球菌(Staphylococcussp.)以及扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)等大量的丝状真菌、细菌和酵母[2-4]，这些微生物共同作用成就了黄酒独特的风味。

不同的微生物在红曲黄酒酿造中发挥着不同的作用，红曲霉、黑曲霉等丝状真菌的主要功能是分泌淀粉酶将淀粉分解为可发酵糖。酵母菌在酿造中尤为重要，不但将糖转化成为乙醇和二氧化碳，并通过其他一系列复杂的生化反应生成甘油、脂肪酸、杂醇、醛类及酯类等风味物质[5]。黄酒酿造中的酵母以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为主，但毕赤酵母(Pichia)、 假丝酵母(Candida)、隐球酵母(Cryptococcus)、红酵母(Rhodotorula)、复膜孢酵母(Saccharomycopsis)等非酿酒酵母(non-Saccharomyces)也参与其中[6]。不同菌株间生长代谢存在显著的差异，使酒体产生不同的口感、风味及香气，赋予黄酒地域特色。本研究对红曲中的非酿酒酵母菌株进行分离鉴定，并采用纯种发酵的方式酿造黄酒，分析非酿酒酵母对红曲黄酒风味成分的影响，以期探究红曲黄酒风味物质的形成规律，为优良非酿酒酵母菌株的选育提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料和试剂 红曲收集于温州和平阳；紫红曲霉由温州大学发酵工程实验室筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(保藏号CGMCC16790)；黄酒酿造活性干酵母，购自安琪酵母股份有限公司(湖北宜昌)。3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)、邻苯二甲醛(ortho-phthalaldehyde, OPA)、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、乳酸、乙酸、酒石酸、苹果酸，购自国药集团化学试剂有限公司；色谱纯甲醇、乙腈，购自美国Sigma公司。

1.1.2 分离培养基 马铃薯培养基(potato-dextrose-agar, PDA)，制备平板前加入硫酸链霉素，浓度100 U·mL-1。

1.1.3 主要仪器 1260 InfinityⅡ型高效液相色谱仪、气相色谱-质谱仪(7980A GC-5975C MS)，美国Agilent公司；UV-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用分析仪器有限公司；VS-840K-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；LRH-25OA生化培养箱，广东省医疗器械厂；FE20 pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；50 μm CAR/PDMS/DVB萃取纤维头，美国SUPELCO公司；5424R冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司；T100TMPCR仪，美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分离 取适量红曲加入无菌水，按10-4、10-5、10-6梯度稀释，分别取100 μL稀释液均匀涂布于PDA培养基，28℃恒温培养24～48 h，观察菌落。菌落表面湿润、光滑、黏稠，颜色单调，生长在培养基表面，质地均匀，正、反面、中央与边缘颜色一致的可能是酵母菌[7]。挑选单个菌落进行连续传代培养，3代后为纯种。

1.2.2 酵母菌的分子鉴定 采用Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒(SK8257，上海生工生物工程有限公司)提取纯培养目标菌株的基因组DNA。以酵母通用引物扩增其26S rDNA D1/D2基因区，引物分别为NL1(G C A T A T C A A T A A G C G G A G G A A A AG)和NL4(G G T C C G T G T T T C A A G A C GG)。25 μL反应液(模板DNA 0.5 μL，10×缓冲液2.5 μL，dNTP 1.0 μL，反应酶0.2 μL，引物各0.5 μL， 双蒸水19.8 μL)的PCR反应程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30次循环；最后72℃充分延伸10 min，4℃保存。取5 μL PCR产物，在1.0%琼脂糖凝胶电泳中分离(150 V, 20 min)。用FR980型凝胶成像系统(上海复日科技仪器有限公司)进行分析，将含有目标片段的产物送生工(上海)生物工程有限公司测序，将序列提交到GenBank数据库中，利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，与数据库中已知酵母的26S rDNA 基因序列进行比对，利用 MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

1.2.3 黄酒的酿造 分离的酵母菌种和活性干酵母在PDA液体培养基中28℃培养2 d；红曲菌活化后接入10%的糯米粉培养基中，28℃培养5 d制备纯种液体曲。在500 mL锥形瓶中加入100 g糯米和60 mL蒸馏水，浸泡过夜，纱布封口，在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20 min；冷却后每瓶接入100 mL红曲液体曲以及5 mL酵母菌液，混匀，置于生化培养箱中28℃恒温培养。每隔2 d在无菌条件下进行搅拌，发酵10 d。发酵结束后，发酵醪用滤布过滤，90℃灭菌30 min，置于4℃冰箱用于黄酒风味成分的测定。

1.2.4 还原糖、乙醇、总酸含量和pH值的测定 还原糖含量采用DNS法测定[8]，以葡萄糖为标准品；样品蒸馏后采用酒精计测定乙醇含量；使用酸度计测定pH值；总酸含量采用标准NaOH溶液滴定法测定。

1.2.5 氨基酸含量的测定 样品经2 000 r·min-1离心10 min后，上清液过0.45 μm滤膜，采用OPA柱前衍生化，然后采用HPLC法测定，外标法对各氨基酸含量进行定量[8]。吸取400 μL硼酸缓冲液(pH值10.4)于色谱样品瓶，加入160 μL OPA溶液和80 μL样液，反应5.0 min后进样，进样量10 μL。色谱条件：AdvanceBio AAA色谱柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm，美国Agilent公司)，柱温40℃；采用梯度洗脱，流动相A为0.01 mol·L-1NaH2PO4-Na2B4O7(pH值8.2 )缓冲溶液，流动相B为乙腈-甲醇-水(45∶45∶10)，洗脱程序见表1；流速1.5 mL·min-1；检测波长338 nm，参比波长390 nm。

1.2.6 有机酸含量的测定 样品经2 000 r·min-1离心10 min后，上清液过0.45 μm滤膜，采用HPLC法测定，外标法对样品中酒石酸、苹果酸、乳酸和乙酸进行定量[9]。HPLC条件：Zorbax C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm，美国Agilent公司)；柱温30℃；流动相为0.01 mol·L-1磷酸氢二铵溶液(pH值2.7)；流速为1 mL·min-1；进样量20 μL；检测波长210 nm，参比波长310 nm。

表1 HPLC洗脱程序

1.2.7 挥发性成分的测定 挥发性成分的测定参考Cao等[10]的方法，以2-辛醇为内标，固相微萃取后采用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)法测定。固相微萃取：20 mL顶空瓶中加入6 mL酒样、5 μL内标(2-辛醇，30 mg·L-1)、 1 g氯化钠，于60℃平衡5 min后，用固相微萃取纤维头萃取40 min。GC-MS分析：色谱柱为HP-INNOWAXS毛细管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司)；载气为He，流速1 mL·min-1，分离比5∶1；进样温度为250℃；升温程序为起始温度40℃，保持5 min，以8℃ min-1升至250℃，保持5 min。质谱条件：EI电离源，能量70 eV；离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度250℃，扫描范围30～500 m/z。通过与NIST11、Wiley 等标准谱图的比对检索，以及与相关文献报道的香气成分和保留指数相比较，确认所检出的挥发性成分。

1.2.8 感官评定 根据《GB/T 13662-2018 黄酒》[11]中的感官要求及检查方法进行评价。对不同酵母发酵的酒样进行编号，由10名评价人员组成品评小组对酒样的色泽、香气、口味和风格进行评分，分值为0～10分。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株的分离鉴定

根据酵母菌落的形态学特征挑选单个酵母菌菌落，分离获得了4株酵母菌，分别为CKS-2、CKS-3、CKS-4和CKS-7，传代3次后，确定为纯种酵母菌。提取4株酵母菌株的总DNA，扩增26S rDNA 近5’端的D1/D2 序列并进行测序。将序列提交GenBank，各菌株的登录号分别为MK696269.1、MK696270.1、MK696271.1和MK696272.1。由系统发育树(图1)可知，菌株CKS-2为威克汉姆酵母(Wickerhamomycessp.)，CKS-3为季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)，CKS-4为胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)，CKS-7为德尔布有孢酵母(Torulasporadelbrueckii)。

图1 红曲中分离获得的非酿酒酵母菌株系统发育树

2.2 不同酵母发酵酒样还原糖、乙醇、总酸含量及pH的比较

淀粉在微生物酶的作用下被分解为糖类化合物，不仅为酿造微生物提供营养物质，在酵母菌的代谢作用下生成乙醇，而且残留的糖类可赋予黄酒甜味。由表2可知，不同菌株发酵的酒样中还原糖含量存在差异，其中菌株CKS-3发酵酒样中还原糖含量较高。菌株CKS-7和活性干酵母(对照)发酵酒样中还原糖含量较低，乙醇含量较高，说明这2株酵母可以较好地利用还原糖进行代谢。活性干酵母发酵酒样中的总酸含量(6.00 g·L-1)显著高于非酿酒酵母菌株发酵的酒样，而所分离非酿酒酵母菌株发酵酒样中的总酸含量差异均不显著。菌株CKS-7和活性干酵母发酵酒样的pH值较低，而菌株CKS-2、CKS-3和CKS-4发酵酒样的pH值较高。

表2 不同酵母发酵酒样还原糖、总酸、乙醇含量及pH

2.3 不同酵母发酵酒样氨基酸含量分析

黄酒中含有丰富的氨基酸，主要来源于酿造过程中原料蛋白质的分解和酵母的自溶。活性干酵母和所分离4株非酿酒酵母发酵酒样中各氨基酸含量见表3，不同氨基酸的含量存在差异。活性干酵母发酵酒样中甘氨酸、精氨酸的含量较高；菌株CKS-2发酵酒样中酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸的含量较高；菌株CKS-3发酵酒样中谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸含量较高；菌株CKS-4发酵酒样中天冬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸含量较高；菌株CKS-7发酵酒样中丝氨酸、组氨酸、色氨酸、亮氨酸含量较高，但是各酵母菌株发酵酒样间总氨基酸含量无显著差异。聚类分析表明(图2)，菌株CKS-2、CKS-3和CKS-4发酵的酒样中各种氨基酸含量较为相似，而与对照活性干酵母和菌株CKS-7发酵的酒样差异较大。

表3 不同酵母发酵的红曲黄酒氨基酸含量

图2 不同酵母发酵酒样中氨基酸组分热图分析

2.4 不同酵母发酵酒样有机酸含量分析

有机酸是黄酒的重要风味成分，乳酸、苹果酸等不挥发酸能增加酒的醇厚感、延长回味时间[12]。由表4可知，菌株CKS-7发酵酒样中苹果酸含量最高(1 347.71 mg·L-1)，为对照活性干酵母酒样含量的9.95倍；酒石酸含量在对照活性干酵母和CKS-3发酵酒样中较高，而CKS-4发酵酒样中含量最低(26.54 mg·L-1)；乳酸含量除CKS-3发酵酒样中较低外，在其他酒样中的含量差异不显著；乙酸含量在对照照活性干酵母发酵酒样中最高(1 926.72 mg·L-1)，为CKS-7发酵酒样的4.56倍。

2.5 不同酵母发酵酒样挥发性成分分析

由表5可知，除乙醇外， CKS-2、CKS-3和CKS-4发酵酒样中检出的挥发性物质组分较少(分别为17、21和24种)；而CKS-7发酵酒样中检出的挥发性组分数量与活性干酵母发酵酒样中相近(分别为27和28种)，但热图分析(图3)表明两者在种类组成和含量方面差异较大，在CKS-7发酵酒样中检出的乙酸乙酯、3-乙氧基丙醇、甲酸己酯和十五酸乙酯，在对照活性干酵母发酵酒样中未检出，而且CKS-7发醇酒样中2-苯乙醇的含量达4.102 mg·L-1， 为对照发酵酒样中含量的1.21倍；而对照发酵酒样中的正己醇、乙酸异戊酯、9-十六碳烯酸乙酯、苯甲醛和3-羟基-2-丁酮在CKS-7发酵酒样中未检出。

表4 不同酵母发酵酒样中有机酸的含量

表5 不同酵母发酵的酒样中挥发性组分含量

图3 不同酵母发酵酒样中挥发性组分热图分析

所有酒样中挥发性成分的组成都是以醇和酯为主，乙醇除外，醇和酯的含量占挥发性成分总含量的比例分别为86.68%(对照发酵酒样)、85.89%(CKS-2发酵酒样)、85.47%(CKS-3发酵酒样)、82.94%(CKS-4发酵酒样)和89.05%(CKS-7发酵酒样)。

2.6 不同酵母发酵酒样感官品质的比较

从色泽、香气、口味和风格4个方面对各酵母菌株发酵的酒样进行感官品评(表6)，结果表明，各菌株发酵的酒样色泽之间差异不显著(P>0.05)，均呈红色；香气方面，菌株CKS-7发酵的酒样得分最高，但与对照发酵酒样间差异不显著(P>0.05)；口味和风格方面，可以分为两组，菌株CKS-7和活性干酵母发酵的酒样为一组，得分显著高于菌株CKS-2、CKS-3和CKS-4发酵的酒样(P<0.05)。

3 讨论

红曲黄酒是以糯米为主要原料，添加红曲或乌衣红曲作为糖化发酵剂，在多种微生物共同作用下发酵而成的一种低度黄酒，为浙江南部和福建等地具有鲜明特色的一种黄酒[13-14]，不仅营养丰富，而且含有莫纳可林K(Monacolin K)及其衍生物、天然红曲红色素、γ-氨基丁酸等功能活性物质[15]。酵母菌是酿酒过程中最重要的微生物之一，不仅能进行糖的分解、转化或同化，产生乙醇，而且能产酸和脂类物质，其代谢物种类和数量决定黄酒的品质[9]。红曲黄酒酿造过程中，除酿酒酵母外，还有多种非酿酒酵母参与，包括毕赤酵母、假丝酵母、隐球酵母、红酵母、复膜孢酵母等[6]，这些酵母虽然发酵效率较低，但能合成多种酶，代谢生产酯、酸、高级醇和醛等成分，对黄酒风味的形成具有重要的作用[16]。吕旭聪等[17]对福建红曲黄酒传统酿造过程的酵母菌群进行跟踪分析，分离获得扣囊复膜孢酵母、季也蒙毕赤酵母和粘性红圆酵母3株非酿酒酵母。本研究从浙江南部酿造红曲中分离获得4株非酿酒酵母菌株，经鉴定分别为威克汉姆酵母、季也蒙毕赤酵母、胶红酵母和德尔布有孢酵母。

表6 不同酵母发酵酒样感官品质

红曲黄酒酿造过程中，微生物将糯米中的淀粉降解转化为还原糖、醇类等成分，蛋白质分解成肽类和氨基酸，酒液中还原糖、乙醇、总酸、氨基酸的含量可反应微生物的代谢活动。分离获得的4株非酿酒酵母中，CKS-7代谢能力较强，发酵酒样中乙醇、总酸含量较高(表2)。氨基酸是酿造微生物生长必需的营养物质，也是风味物质的前体，可被转化为高级醇，并且可与糖发生美拉德反应影响酒体的色泽，另外，不同的氨基酸本身具有鲜味、甜味、苦味、酸味和咸味，组合在一起赋予酒体丰富的口感[18-19]，本研究分离获得的非酿酒酵母菌株发酵的酒样中氨基酸总含量差异不显著，但单体间存在差异(表4)。乳酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、富马酸等有机酸普遍存在于传统酿造的黄酒中，其中以乳酸、乙酸和琥珀酸为主[16,20]。苹果酸是三羧酸循环代谢的中间产物，本研究采用纯种发酵，结果表明对照分离的非酿酒酵母菌株产苹果酸能力较强，显著高于酿酒酵母，尤其是菌株CKS-7发酵酒样中苹果酸含量最高(表4)。各菌株发酵酒样中还含有较高浓度的乳酸和乙酸，其合成途径为，葡萄糖经糖酵解途径形成的丙酮酸，可在乳酸脱氢酶的作用下转化生成乳酸，也能在乙醇脱氢酶的作用下转化为乙醇，并在甲酸裂解酶的作用下产生乙酸[20]。

黄酒的挥发性风味成分主要为醇类、酯类、醛类以及少量的酮类和酚类化合物，如异丁醇、正丁醇、异戊醇、正戊醇、正己醇、3-乙氧基丙醇、2-庚醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、苯乙醇、2,3-丁二醇、正辛醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、十四酸乙酯、庚酸乙酯、棕榈酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙醛、己醛、糠醛、2-苯基-2-丁烯醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛、3-羟基-2-丁酮、1-辛烯-3-酮、2-壬酮、苯乙酮、愈创木酚、2,3,5-三甲基吡嗪等[21-23]。红曲黄酒中的关键挥发性成分有异丁醇、异戊醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、2-壬酮、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、糠醛、苯甲醛和β-苯乙醇等[24]，其中，高级醇是酿造过程中由蛋白质、氨基酸及糖类化合物的分解代谢而成，在酿造酒的香气物质中占有较大的比例，而酯类物质是酒体果香的主要来源[25]。不同产地的黄酒风味各异，其主要原因是酿造微生物的不同， 即便是菌株的差异也会导致挥发性风味成分的极大变化[26]。酿酒酵母除代谢产生乙醇外，也会合成一些高级醇和酯类风味成分[27]；而非酿酒酵母在酒体风味物质形成方面具有重要的作用，毕赤酵母与酒体中挥发性醇和酯的含量直接相关[28]；卡利比克毕赤酵母(P.caribbicaUFLA CAF733) 发酵可提高2-苯乙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯和苯乙酸乙酯等挥发性成分的含量[29]；原苗苗等[30]比较了不同非酿酒酵母产香的差异，结果表明美极梅氏酵母产生的发酵香气浓度最高(206.27 mg·L-1)， 主要成分为苯乙醇和3-甲基丁醇，葡萄有孢汉逊酵母能够产生乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、乙酸-2-苯乙酯、辛酸和香茅醇等丰富的香气成分；德布尔有孢酵母可形成乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙醛等风味成分[31]，本研究分离获得的CKS-7属于德布尔有孢酵母菌株，具有相似的效果，而且能产生大量的2-苯乙醇，该成分具有蜜香玫瑰味的清雅香气，是黄酒的主体香味成分之一[16,32]；感官评定结果也表明，菌株CKS-7发酵酒样香气指标得分较高，与挥发性成分的分析结果一致。

4 结论

本试验初步研究了浙江南部红曲中的酵母，分离获得4株非酿酒酵母菌株，CKS-2为威克汉姆酵母(Wickerhamomycessp.)、CKS-3为季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)、CKS-4为胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、CKS-7为德尔布有孢酵母(Torulasporadelbrueckii)。纯种发酵试验表明，这些菌株发酵酒样在有机酸、氨基酸及挥发性成分组成方面与酿酒酵母存在显著的差异，其中菌株CKS-7产苹果酸、2-苯乙醇等风味成分的性能良好，可提升红曲黄酒的品质，是潜在的可应用于红曲黄酒酿造的优良菌株，但其风味成分形成机理及其与酿酒酵母间的相互作用需作进一步研究。