血浆Dickkopf-1在类风湿关节炎患者中的表达及其与外周血T细胞亚群的相关性

曹 迪，王 燕△，王柳青，孙晓麟，黄 妃，孟 洋，任丽丽，张学武△

(1. 郑州大学第五附属医院风湿免疫科， 郑州 450000； 2. 北京大学人民医院风湿免疫科， 北京 100044； 3. 遵义医科大学附属医院肾病风湿科， 贵州遵义 563000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其特征是持续性滑膜炎，导致软骨和骨质的破坏，并导致多个关节的畸形、功能障碍和生活质量下降[1]。最近，越来越多的证据表明RA的发病机制受到多种因素的影响，其中Dickkopf-1(DKK-1)的异常表达引起的骨代谢功能障碍参与了RA中病理性骨侵蚀的发病机制。一直以来，T 细胞过度活化被认为是 RA 发病的根本原因，RA 患者体内常存在着异常活化的 T 细胞和/或 T 细胞亚群数量的改变。目前研究认为主要是Th1/Th2、Th17/Treg两组细胞间的失衡，导致Th1、Th17产生的促炎细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17、TNF-α等水平升高，而Th2、Treg细胞产生的抗炎细胞因子水平降低，从而导致自身免疫功能紊乱，诱发关节炎的发生[2]。

Chae等[3]发现DKK-1在Foxp3+Treg细胞中表达，以膜结合形式抑制T细胞介导的自身免疫性结肠炎。Chae等[4]关于 DKK-1与哮喘发病的研究结果提示 DKK-1在Th2介导的炎症反应中发挥重要作用，将 DKK-1与T细胞的研究进一步深入,以上研究结果提示DKK-1可能影响T细胞的分化和功能。然而，DKK-1是否调控RA患者T淋巴细胞参与的自身免疫性炎症还不清楚,因此本研究旨在分析RA患者中血浆DKK-1水平变化与外周血T细胞亚群、临床指标之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究随机选取2018年9月至2019年5月就诊于北京大学人民医院风湿免疫科门诊及住院的RA患者(实验组)32例，其中男6例、女26例；平均年龄(63.09±11.07)岁，病程平均(12.06±10.43)年，均符合2010年美国风湿病学会(American College of Rheumatology, ACR)修订的RA分类标准[5]，且近半年未使用糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂治疗。排除精神性疾病,肿瘤,合并严重脏器受损,重症类风湿关节炎,处于妊娠、分娩或哺乳期的女性患者。另选取年龄和性别相匹配的体检中心的健康对照(对照组)20例，均无感染、免疫等可能与RA相关的疾病，其中男7例，女13例，平均年龄(59±8.03)岁，上述所有患者均留取血浆。本实验获得北京大学人民医院伦理委员会的批准(批准号： 2017PHB165-01)， 研究对象包括患者和健康人均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1样本的采集和处理 清晨空腹采集RA患者和健康对照组静脉全血5 mL置于肝素钠采血管中；采用淋巴细胞分离液(Ficoll法)分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)后，吸取上层血浆分装于无菌管中，置于-80 ℃ 冰箱中保存备用；中间的PBMCs层用于流式检测T细胞亚群。

1.2.2外周T细胞亚群的检测 将搜集的PBMCs用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)洗涤后，将细胞转移至流式管中，加入200 μL的PBS重悬，向细胞悬液中加入荧光标记的抗体CD3-AF700、CD4-FITC、CD8-PerCp、CD25-PE、CD127-BV605、CD161-PE-CF594、CD45RA-BV510(购自美国BioLegend公司)、CXCR5-AF647(购自美国BD Biosciences公司)进行染色，4 ℃避光孵育30 min后，加入2 mL PBS，1 800 r/min离心6 min洗涤细胞，最后加入200 μL的PBS重悬，过滤后上机检测。采用 BD FACS Arial Ⅱ流式细胞术仪检测各细胞亚群的表达水平，并使用FlowJo软件(V7.6.1)进行数据分析。外周血T细胞亚群的定义如下:Treg：CD4+CD25hiCD127lo；天然型nTreg：CD4+CD45RA+CD25lo；激活型aTreg：CD4+CD45RA-CD25hi；分泌型sTreg：CD4+CD45RA-CD25lo；Teff：CD4+CD25-；Tfh：CD4+CXCR5+。

1.2.3血浆DKK-1水平的检测 采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血浆DKK-1水平，DKK-1商品化试剂盒购自杭州联科公司，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.4临床和实验室指标 收集临床和实验室数据：年龄，性别，病程，红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)，C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)，疾病活动度评分(disease activity score 28，DAS28)，类风湿因子(rheumatoid factor, RF)，抗环瓜氨酸肽抗体(anti-citrullinated protein antibody, anti-CCP)，免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，免疫球蛋白A (immunoglobulin A, IgA)，免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)，补体C3(complement C3)，补体C4(complement C4)，白细胞(white blood cell，WBC)计数，中性粒细胞百分比(neutrophil ratio, Neu)。

1.3 统计学分析

所有数据均采用SPSS 25.0统计软件分析，作图采用Graphpad prism 8.0.2软件。正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，非正态分布的计量资料用中位数(最小值，最大值)表示。两组间计量资料按数据是否符合正态分布，采用独立样本t检验或非参数Mann-WhitneyU检验；多组间计量资料服从正态分布的采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组比较，如果有统计学意义，进一步用Bonferroni进行两两比较。非正态分布用Kruskal-WallisH检验进行多组之间两两比较，相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05表示差异具有统计学意义，用受试者工作特征曲线(recei-ver operating characteristic curve，ROC)确定DKK-1水平的临界值。

2 结果

2.1 研究对象资料

研究对象的临床基本资料见表1。

表1 研究对象的临床基本资料Table 1 Basic clinical data of study subjects

2.2 RA组与健康对照组血浆DKK-1水平、外周血CD8+CD161+T细胞百分比比较

RA组血浆DKK-1水平显著高于健康对照组[(124.97±64.98) ng/Lvs. (84.95±13.74) ng/L，P<0.05]，见图1A。RA组外周血CD8+CD161+T细胞百分比显著高于健康对照组(19.27%±11.58%vs. 11.64%±5.44%，P<0.05)，见图1B。

A, Plasma DKK-1 levels in RA and healthy controls; B, Percentage of CD8+CD161+T cells in peripheral blood of RA group and healthy control group.RA, rheumatoid arthritis; HC, healthy controls；DKK-1，Dickkopf-1.图1 RA组和健康对照组血浆DKK-1的水平及外周血CD8+CD161+T细胞的百分比Figure 1 Levels of plasma DKK-1 and percentage of peripheral blood CD8+CD161+T cells in RA group and healthy control group

2.3 RA组血浆DKK-1水平与临床指标之间的相关性

血浆DKK-1水平与ESR(r=0.406，P=0.021)、DAS28评分(r=0.372，P=0.036)、IgG(r=0.362，P=0.042)、IgA(r=0.377，P=0.033)呈正相关；与年龄、病程、CRP、RF、抗CCP抗体、IgM、补体C3、补体C4、WBC、Neu无相关性。

2.4 血浆DKK-1水平与外周血T细胞亚群之间的相关性分析

通过ROC分析，由ROC曲线下面积为0.667(95%CI： 0.519，0.815)确定血浆DKK-1浓度的临界值为101.00 ng/L,根据这个临界值把RA患者血浆DKK-1水平分为DKK-1升高组和DKK-1正常组,与健康对照组比较所对应的各T细胞亚群的百分比见图2。

A,Treg percentage；B，nTreg percentage；C，aTreg percentage； D，sTreg percentage；E，Teff percentage；F，Tfh percentage； G，CD4+CD161+T cell percentage；H，CD8+T cell percentage；I，CD8+CD161+T cell percentage；HC, healthy controls; DKK-1, Dickkopf-1.图2 DKK-1升高组、DKK-1正常组、健康对照组外周血T细胞亚群百分比之间的差异Figure 2 Differences in peripheral blood T Cell subsets in DKK-1 elevated group, DKK-1 normal group, and healthy control group

血浆DKK-1升高组的RA患者外周血CD8+CD161+T细胞百分比较健康对照组和DKK-1正常组患者显著升高(P=0.001), 进一步的相关性分析两者呈正相关(r=0.413，P=0.019)；血浆DKK-1升高组患者外周血nTreg细胞百分比(P=0.027)和DKK-1正常组患者外周血nTreg细胞百分比(P=0.019)显著高于健康对照组；血浆DKK-1正常组患者外周血Teff细胞百分比显著高于健康对照组(P=0.045)；血浆DKK-1升高组患者外周血Tfh细胞百分比(P=0.001)和DKK-1正常组患者外周血Tfh细胞百分比(P=0.009)显著高于健康对照组；血浆DKK-1正常组外周血CD8+T细胞百分比显著高于健康对照组(P=0.001),与Treg、aTreg、sTreg、CD4+CD161+T细胞无相关性，见图2、3。

DKK-1，Dickkopf-1.图3 RA患者血浆DKK-1水平与外周血CD8+CD161+T细胞之间的相关性Figure 3 Correlation between plasma DKK-1 levels and peripheral blood CD8+ CD161+T cells in RA patients

2.5 外周血CD8+CD161+T细胞百分比与临床指标的相关性分析，

外周血CD161+CD8+T细胞与ESR(r=-0.415，P=0.004)、CRP(r=-0.393，P=0.007)、DAS28评分(r=-0.392，P=0.007)、RF(r=-0.535，P<0.001)、抗CCP抗体(r=-0.589，P<0.001)、IgG(r=-0.368，P=0.012)、IgM(r=-0.311，P=0.035)呈负相关，与年龄、病程、IgA、补体C3、补体C4、WBC、Neu无相关性。

3 讨论

DKK-1于1998年由Glinka等[6]报道，是经典Wnt途径的内源可溶性抑制剂，Wnt信号通路在骨稳态中起着至关重要的作用。DKK-1一方面主要是通过抑制Wnt信号传导途径阻断成骨细胞的形成和分化并诱导未成熟成骨细胞的凋亡，导致骨形成不足；另一方面可能是通过抑制Wnt信号通路间接的增强核因子kappa B受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)介导的破骨细胞生成，从而抑制骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的分泌，改变OPG ∶RANKL比率，促进破骨细胞分化增值以促进骨吸收[7]，从而参与RA中骨破坏的发生机制。DKK-1作为关节重塑的主要调控因子在关节炎模型中得到很好的研究，但对于RA患者循环中DKK-1的功能知之甚少，而通过本次研究，我们的结果展示RA患者血浆DKK-1浓度显着高于健康对照组(P<0.05)， DKK-1水平与ESR、DAS28评分、IgG、IgA呈正相关，与年龄、病程、CRP、RF、抗CCP抗体、IgM、补体C3、补体C4、WBC、Neu无相关性，这与之前报道的结果一致[8]，Gómez等[9]的研究结果显示，在患有严重疾病活动或骨侵蚀的患者通常具有更高的DKK-1表达，表明血浆DKK-1参与RA患者骨侵蚀的发病机制并与临床疾病活动程度之间存在显著相关性。结合Gómez等[9]的研究和本次实验结果表明，随着疾病进展和骨质破坏的增加，DKK-1的血浆水平将增加，因此血清DKK-1可用作骨破坏的标志物。此外我们还检测了DKK-1升高组与DKK-1正常组临床指标之间的差异，但因两组之间差异无明显统计学意义，故未将结果列出。

为了明确DKK-1对于外周血T细胞数量及功能的影响，本研究检测了多种T细胞亚群，并分析了DKK-1与外周血T细胞亚群之间的相关性，结果发现RA组血浆DKK-1水平与外周血CD8+CD161+T细胞百分比呈正相关，与Treg、nTreg、aTreg、sTreg、Teff、Tfh、CD4+CD161+T、CD8+T细胞无相关性。

Treg细胞是抑制自身反应性淋巴细胞的T细胞亚群，Th17和Treg细胞之间的失衡已被确定为RA发病机制中的关键因素。本研究未发现DKK-1与Treg细胞之间的相关性，而Chae等[3]证明Foxp3+Treg细胞以膜结合形式表达DKK-1，以抑制T细胞介导的结肠炎。DKK-1在Foxp3+Treg细胞中的意外定位和功能表明，DKK-1功能是通过以细胞-细胞接触依赖方式和旁分泌方式控制T细胞增殖而成为外周耐受的重要调节剂。DKK-1在Foxp3+Treg细胞中控制外周耐受的新型免疫调节作用，突显了DKK-1是控制自身免疫性疾病的引人注目的分子靶标，而在RA患者中DKK-1是否与Treg细胞存在联系有待进一步扩大样本量进行研究。

CD161是C型凝集素样受体，属于杀伤细胞凝集素样受体亚家族(killer cell lectin-like receptor subfamily B member1，KLRB1)， 也称为NKR-P1[10]，其在CD4+、CD8+T、NK细胞上广泛表达，而关于CD161在CD8+T细胞中的表达在丙型肝炎、肠炎、结核等疾病中都有研究，但在类风湿关节炎的研究中很少见。Mitsuo等[11]在关于CD161+CD8+T细胞的研究中发现SLE、MCTD、SSc和PM/DM患者与健康供体相比，CD161+CD8+T细胞的百分比和绝对数目均减少，而在RA患者中CD161+CD8+T细胞的百分比没有降低，提示RA的发病机制可能与其他风湿病不同，可能反映了一个事实，即所涉及的CD8+T细胞的特征因疾病类型而异，而本次研究的结果却与之不同，从研究结果来看RA组CD161+CD8+T细胞百分比明显高于健康对照组(P<0.05)， 也就是说CD161+CD8+T细胞可能在类风湿关节炎的发病机制中发挥部分作用，而CD161+CD8+T细胞与ESR、CRP、DAS28评分、RF、抗CCP抗体、IgG、IgM呈负相关，说明随着CD161+CD8+T细胞百分比的增多，RA疾病活动相关的临床指标降低，表明CD161+CD8+T细胞可能在RA中发挥免疫负调节作用，并一定程度上抑制自身免疫性疾病的发生。之前有研究表明CD161+CD8+T细胞与CD8+NKT细胞密切相关[11]，而CD8+NKT细胞可通过识别和杀死抗原特异性树突状细胞来抑制CD4和CD8 T细胞反应，因此，CD161+CD8+T细胞可能像CD8+NKT细胞一样，对免疫反应产生免疫抑制作用。

Diarra等[8]在人类类风湿关节炎模型中确定肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作为DKK-1的关键诱导剂。CD161+CD8+T细胞具有效应细胞的功能，特别是具有分泌促炎性细胞因子(如IL-17、IL-22、TNF-α、IFN-γ或GM-CSF)的能力[12]，而在上述相关性分析中已经明确RA患者中CD161+CD8+T细胞的百分比与DKK-1的水平呈正相关，可能是CD161+CD8+T细胞产生的TNF-α，诱导DKK-1的表达上调，从而参与RA的骨质破坏，但在二者中的作用机制有待进一步研究。

综上所述，一方面RA患者外周血T细胞亚群中的CD161+CD8+T细胞明显升高，同时血浆DKK-1水平也有所升高，这可能与RA的发病机制及促炎细胞因子的分泌有关；另一方面CD161+CD8+T细胞在某种程度上可能会抑制自身免疫的发生。因此CD161+CD8+T细胞既可以是致病性的也可以是保护性的。DKK-1在参与RA的骨质破坏及评估RA患者的疾病活动情况中发挥着重要的作用，后续研究应进一步探究RA的发病机制，为临床防治提供理论依据。

本研究仍存在许多不足之处，首先对于RA患者外周血CD161+CD8+T细胞产生的促炎性细胞因子水平的未予测定，在接下来的研究中可以检测细胞因子的水平变化，来进一步分析DKK-1对RA患者外周血CD161+CD8+T细胞及其分泌的细胞因子的影响；其次本研究纳入RA患者及健康对照者例数较少，未与其他自身免疫病患者作对照，可能会影响研究结果，之后需要对更多的人群进行更深入的研究；最后未纳入RA患者的影像学资料，在后续研究中将增加影像学数据，来更加充分地说明DKK-1与骨破坏的关系。