雷公藤多苷致DOR小鼠子宫内膜生长发育及卵巢相关干细胞因子、缝隙连接蛋白表达变化

赵阳春，江丽燕，胡凤英，祝秀芝

(1.浙江中医药大学附属第二医院妇产科，浙江 杭州 310000；2.浙江省丽水市莲都区人民医院，浙江 丽水 323000)

卵巢储备功能下降(Decreased ovarian reserve，DOR)是指人类雌性卵巢器官产生成熟卵泡的能力下降或不足，导致其性激素水平低下和生育能力下降，是妇产临床工作中的常见病[1]，主要表现为月经过少或闭经、不孕等，并多伴有潮热多汗、焦虑等自主神经症状，可发展为卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)。近年来随着生活工作环境的变化、心理压力增加，DOR发病率呈逐渐增加[2]，严重影响女性生育潜能及生活质量。目前DOR病因尚未明确，激素替代治疗是西医常用手段，但对DOR/POF导致的不孕疗效并不理想，且可导致子宫内膜增生、乳腺癌发病机率上升[3]。雷公藤多苷是由雷公藤根茎中提取制成，其已广泛应用于临床治疗，具有不可或缺的功效[4]。但长期服用该药可导致诸多不良反应甚至是不可逆毒性损伤，对女性而言，可造成女性生殖系统药源性损伤[5]。本研究实验观察雷公藤多苷致DOR小鼠子宫内膜生长发育及卵巢相关干细胞因子、缝隙连接蛋白的表达变化，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 实验动物

健康雌性SD小鼠20只，体重(18.00±4.00)g，购于江苏博深生物科技有限公司。

1.1.2药物

雷公藤多苷片(规格：10mg/片 国药准字Z33020422 浙江得恩德制药股份有限公司生产)，采用纯净水溶化。

1.1.3 主要试剂

兔抗鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)(北京美科美生物技术开发有限公司)；卵巢干细胞因子(Stem cell factor，SCF)、缝隙连接蛋白37(Connexin 37，Cx37)引物(英潍捷基贸易有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(山东光合农业科技有限公司)。

1.1.4主要仪器

组织包埋中心(SAKURA公司)；CS-VI型摊片烤片机(孝感市宏业医用仪器有限公司)；倒置荧光显微镜(上海辛卯科学仪器有限公司)；酶联免疫检测仪(芬兰雷勃公司)；紫外透射仪(上海复享光学股份有限公司)；显微图像分析系统(北京启航博达科技有限公司)；可见分光光度计(上海分析仪器厂)。

1.2实验分组与动物造模

将购入的小鼠进行1周适应性喂养，然后连续10天进行阴道涂片并观察，选择动情周期正常的20只雌性SD小鼠作为实验对象。按随机数字表法将其分为对照组及模型组。对照组10只小鼠给予以正常饮食，不进行其他操作。模型组10只小鼠给予以雷公藤制剂灌胃造模，剂量为75 mg/kg，1次/日，连续进行2周后，予以小鼠0.9%的NaCl，剂量为2 mL/kg，1次/日，连续进行5周。末次给药24小时后，将小鼠进行麻醉取血并处死，备用。

1.3观察指标与检测方法

①检测小鼠子宫内膜指数：将小鼠颈椎脱臼处死，开腹取出子宫，计算子宫指数，脏器指数%=脏器重量/体重×100%；②采用免疫组化法检测小鼠子宫内膜VEGF及其血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2)、SCF、Cx-37平均光密度值，严格按照试剂盒操作步骤进行。将子宫称重，去左侧段置于生理盐水中进行冲洗，采用10%甲醛固定，进行烤片，常规脱蜡脱水、抗原修复等步骤，滴加一抗、二抗孵育，行DBA显色，最苏木素复染、中性树胶封片，置于显微镜下观察；③取小鼠腹主动脉血，离心取上清液冷冻保存。采用双抗体夹心检测法检测小鼠黄体生成素(Luteinizing hormone，FSH)、促卵泡素(Follicle stimulating hormone，FSH)、雌二醇(Estradiol，E2)水平。

1.4统计学方法

2 结果

2.1两组小鼠子宫内膜形态比较

对照组卵巢结构完整原始卵巢形态丰富，各级卵泡结构整齐，卵母细胞清晰可见，形态饱满；颗粒细胞分布均匀，血管及黄体丰富，未见病理性纤维化增生及炎性浸润；见图1(A)。模型组卵巢萎缩，各级卵泡数量减少，颗粒细胞排列紊乱，黄体较少，可见病理性纤维化增生及炎性浸润，见图1(B)。

图1 两组小鼠子宫内膜形态比较(HE染色×100)

2.2两组小鼠子宫内膜生长发育情况比较

模型组小鼠子宫指数(0.21±0.03)较对照组(0.24±0.01)明显降低(t=3.00，P=0.01)；模型组小鼠子宫内膜VEGF和VEGFR2的表达水平较对照组均明显降低，差异有统计学意义(t=3.86，P<0.01；t=111.80，P<0.01)，见表1。

表1 两组小鼠子宫内膜生长发育情况的比较

2.3两组小鼠SCF、Cx-37表达水平的比较

模型组小鼠SCF的表达水平(0.33±0.04)较对照组明显升高(0.14±0.01)，差异有统计学意义(t=14.57，P<0.01)；模型组小鼠Cx-37表达水平(0.11±0.02)较对照组(0.36±0.02)明显下降，差异有统计学意义(t=27.95，P<0.01)，见表2。

表2 两组小鼠SCF、Cx-37表达水平的比较

2.4两组小鼠性激素水平的比较

模型组小鼠血液中FSH水平(31.14±2.07 IU/L)高于对照组(19.08±1.36 IU/L)，差异有统计学意义(t=15.40，P<0.01)；对照组小鼠血液中LH水平为20.28±1.36 ng/L，模型组LH水平为51.42±3.89 ng/L，两组小鼠血液中LH水平差异有统计学意义(t=23.90，P<0.01)；模型组小鼠血液中E2水平(52.39±8.01 ng/L)明显低于对照组(91.59±5.28 ng/L)，差异有统计学意义(t=12.92，P<0.01)，见表3。

表3 两组小鼠性激素水平的比较

3讨论

3.1 雷公藤多苷致DOR小鼠子宫内膜生长发育的变化

卵泡在卵巢皮质中生长、发育并逐渐形成可育卵泡的能力，反映女性内分泌激素水平和生殖潜能[6]。DOR是指卵巢中可招募卵泡的数量骤减，生产卵子的能力不足且卵子质量下降，严重影响女性的生殖能力。临床上主要体现在月经、生育变化以及不良生育状态。如月经流量低，甚至闭经、不规则月经、反复自然流产等，症状严重者可表现为潮热、焦虑等围绝经期症状，影响患者的生活质量。既往研究显示DOR的发病率为1%～3%，在闭经中占2%～10%，DOR不经治疗1～6年可发展为POF，进一步损害女性的生殖健康[7]。DOR的的病因尚不明确，可能与年龄、自身免疫因素(包括细胞免疫、体液免疫等)、遗传学因素(包括X染色体数目异常、常染色体异常和基因突变等)、酶缺陷(相关酶的缺乏和失活)、医源性因素(包括放疗、化疗、手术、感染等)以及环境毒物因素等。目前临床对DOR的西医治疗主要采用激素替代疗法(Hormone Replacement Therapy，HRT)及对症支持治疗为主，以缓解卵巢功能降低所致的生殖激素低下状态。但既往临床研究显示长期应用性激素有一定副作用，特别是对雌激素依赖性肿瘤有一定风险，故其应用受到一定限制，且疗效具有不稳定性[8]。既往临床药理学研究显示，雷公藤制剂长期服用不加以干预可导致月经紊乱等副作用，对女性生殖系统的影响较大[9]。子宫内膜形态是评价子宫内膜生长发育必不可少的指标，受卵巢激素变化的调节，若其生长发育不良可导致月经稀少、不孕等症状。内分泌严重失调、药物影响、手术导致内膜损伤、子宫畸形发育等均可导致子宫内膜生长发育不良。本研究结果显示，对照组卵巢结构完整原始卵巢形态丰富，各级卵泡结构整齐，卵母细胞清晰可见，形态饱满；颗粒细胞分布均匀，血管及黄体丰富，未见病理性纤维化增生及炎性浸润。模型组卵巢萎缩，各级卵泡数量减少，颗粒细胞排列紊乱，黄体较少，可见病理性纤维化增生及炎性浸润。雷公藤多苷可破坏卵巢结构功能，导致子宫内膜生长发育不良。VEGF是一种具有调节子宫内膜生长、胚胎发育及卵巢血管生成等作用的细胞因子，是重要的血管形成因子和血管通透因子，是评价子宫内膜生长状况的重要生物学指标[10]。血管生成的速度在正常情况下较慢，且在发育完成后可以保持较高的稳定性。而女性生殖组织中的血管生成会定期更新。VEGF与其受体结合可促进血管内皮细胞增殖、生长发育，保持血管的通透性。本研究结果显示：相较于对照组，模型组小鼠子宫内膜指数、VEGF及VEGFR2水平均明显降低。因此，雷公藤多苷可导致VEGF及VEGFR2水平降低，影响生殖组织血管生成。

3.2雷公藤多苷对DOR小鼠SCF、Cx-37表达的影响

女性生殖功能随着自身的发育也逐渐成熟，性激素也周期性波动并定期释放，刺激促进卵泡从初级卵泡发育到成熟卵泡。而卵泡发育不全是导致卵巢功能损伤的主要因素。SCF是一种粒细胞来源的生长因子，其在颗粒细胞、卵泡膜细胞间质细胞中均存在表达，且可通过调控细胞增殖与分化，是一种可调节卵巢生长发育及功能生理平衡的旁分泌因子，其可与卵巢颗粒细胞相互作用，实现稳态，进而调节卵母细胞生长发育。在病理条件下，其水平升高[11]。既往有学者发现，卵巢颗粒细胞可产生SCF，虽机制仍不明确，且发现SCF维持一定水平后可以刺激调节卵巢颗粒细胞的生长，发育和动态平衡，两者相辅相成，形成反馈系统以实现“体内平衡”共同调节早期卵泡的生长和发育。细胞缝隙连接是一种由连接蛋白组成的蛋白质连接通道，其广泛存在于生殖细胞之间，Cx37可连接卵母细胞及颗粒细胞间的缝隙，若缺失可影响卵泡成熟过程[12]。本研究结果也显示相较于对照组，模型组小鼠Cx-37表达水平明显下降，SCF水平明显上升。

3.3 雷公藤多苷对DOR小鼠性激素水平的影响

卵巢是重要的女性生殖器官，其主要功能可分为两部分：卵排出和激素分泌。卵巢中储备大量卵泡，而卵泡的发育和成熟必须经历原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡和成熟卵泡四个阶段。如果女性卵巢功能受损，卵泡衰减速度加剧，而成熟卵泡则下降。而功能良好的成熟卵泡对女性生殖至关重要。在临床对DOR/POF患者的诊治过程中，以FSH，LH，E2等性激素为卵巢功能评价指标。其中以E2为直接诊断指标，以FSH和LH为间接指标。FSH是性腺轴分泌的主要激素，在促进卵泡成熟和雌二醇的产生过程中起着重要作用；其作用机理是通过结合受体偶联的G蛋白来调节卵泡的形成过程。除了FSH，激素LH对于卵泡发育直至排卵期也至关重要。既往研究表明LH可以与FSH共同促进卵泡成熟并对卵巢黄体产生起到协助作用；E2是POF的直接诊断指标，在FSH的作用下由窦卵泡产生，其水平与卵泡的数量相互影响，且可以通过反馈的方式调节FSH的水平，使其处于正常的“稳定状态”[13]。本研究结果显示：相较于对照组，模型组小鼠FSH、LH水平明显升高，E2水平明显下降，说明雷公藤多苷导致卵巢功能严重受损，激素水平紊乱。

综上所述，雷公藤多苷可引起小鼠体内Cx-37表达下降，SCF表达上升，导致小鼠卵巢储备功能下降，抑制子宫内膜血管生成。